王莎莎，关键，王珊，成芳娟，任侠，许西琳，高岩

新疆地区哈萨克族慢性阻塞性肺疾病易感性与ADAM33基因多态性的关系

王莎莎，关键△，王珊，成芳娟，任侠，许西琳，高岩

目的探究整合素-金属蛋白酶33（ADAM33）基因F+1、S2、T1、ST+5位点多态性与新疆地区哈萨克族慢性阻塞性肺疾病（COPD）易感性的关系。方法选择193例对照组及197例COPD病例组，提取外周血标本DNA，运用SNaPshot SNP分型技术检测ADAM33基因各位点多态性。结果病例组与对照组F+1位点的基因型及等位基因频率分布比较差异有统计学意义（P＜0.05）。病例组中，F+1位点CC、CT、TT 3种基因型肺功能相关指标第1秒用力呼气容积（FEV1）预计值（%）、FEV1/用力肺活量（FVC）比较差异无统计学意义。病例组与对照组S2、ST+5、T1位点的基因型及等位基因频率分布比较差异无统计学意义；F+1、S2位点进行单体型分析显示Hap1（CC）在对照组和病例组分布差异有统计学意义（P＜0.05），且OR＜1，表明此单体型可能降低发生COPD的风险；Hap3（TC）在对照组和病例组分布差异有统计学意义（P＜0.05），且OR＞1，表明此单体型可能增加了COPD发病的风险；Hap2（TG）、Hap4（CG）单体型在2组间分布差异无统计学意义；病例组及对照组T1、ST+5位点3种单体型比较差异无统计学意义。结论ADAM33基因F+1位点多态性可能与新疆哈萨克族人群COPD的发生有关。

肺疾病，慢性阻塞性；ADAM蛋白质类；多态性，单核苷酸；哈萨克族；ADAM33基因；单体型

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种呼吸系统的常见疾病，其特点为气流持续性受限，并且疾病的发展呈渐进性。目前COPD发病机制尚未完全清晰，可能受环境以及遗传这两方面因素影响。2002年

Van Eerdewegh等［1］通过定位克隆的方法确定了ADAM33基因是支气管哮喘疾病的影响因素，且与气道高反应性也存在相关性。随后国内外学者对该基因和COPD之间的关系进行研究，发现ADAM33基因在COPD的发病过程中发挥作用，并显示其单核苷酸多态性（SNP）与肺功能的快速下降也存在相关性［2］。本研究旨在探究哈萨克族人群ADAM33基因多态性与COPD易感性的相关性，进一步从分子水平研究新疆地区哈萨克族人群COPD病程进展中遗传因素的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象选择2013年5月—2015年5月石河子大学医学院第一附属医院、伊犁州友谊医院、伊犁州新华医院及塔城沙湾县人民医院呼吸内科住院部、门诊确诊为COPD的哈萨克族患者197例作为病例组，符合2013年中华医学会呼吸分会制定的COPD诊疗指南的诊断标准，并且在入组前未使用过茶碱类、β2受体激动剂和糖皮质激素类药物进行对症治疗。对照组为同期在以上医院门诊或体检中心挑选出的哈萨克族体检健康者193例。排除肺部其他疾病以及胸部手术史。2组性别、年龄、吸烟指数比较差异无统计学意义，肺功能第1秒用力呼气容积（FEV1）预计值（%）、FEV1/用力肺活量（FVC）差异有统计学意义（肺功能选在病例组病情处于稳定期时测定），见表1。本次试验全部入选人员必须签署知情同意书并且通过我院伦理委员会的同意后方可进行。

Tab.1Basic information of these two groups表1 2组基本资料比较

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取抽取全部研究对象的静脉血（手背部）5 mL，EDTA抗凝，采用由北京TIANGEN生化科技公司提供的非离心柱型试剂盒提取血液基因组DNA，并储存于-80℃冰箱以便备用，运用超微量分光光度计对DNA纯度及浓度进行检测。

1.2.2 Q-1、T2位点多态性的测试（1）设计引物。根据GenBank提供的基因序列，运用Primer3软件对引物进行设计，F+1位点的引物序列为：F 5′-GAGGCCACTGGAACCTCCTGTT-3′，R 5′-GTGGTGCACCTGCTCAGGACTC-3′；S2位点：F 5′-GAGGCCACTGGAACCTCCTGTT-3′，R 5′-GTGGTGCA CCTGCTCAGGACTC-3′；ST+5位点：F 5′-TGCCCACAGA CCCTCAATCAC-3′，R 5′-GGGCCCAGCACATCTTTTCAC-3′；T1位点：F 5′-AGGGTCTGGGAGAAATGGTGGA-3′，R:5′-CACTGTGCCAACCTCCTGGACT-3′。4个位点扩增长度分别为278、365、369、311 bp。（2）对目的片段进行PCR扩增反应。总PCR反应体系为10 μL，包含1× HotStarTaq buffer、Mg2+3.0 mmol/L、dNTP 0.3 mmol/L，HotStar-Taq polymerase（Qiagen Inc.）1 U、DNA样本1µL和多重PCR引物1µL。循环PCR程序：循环11次以下过程，变性95℃2 min；变性94℃20 s，退火65℃40 s，每次循环降低0.5℃，延伸72℃1.5 min；变性94℃20 s，退火59℃30 s，延伸2℃1.5 min，循环24次；延伸72℃2 min，在4℃条件下保存。取扩增产物1.5 μL制胶后进行电泳检测，若有目的片段则验证扩增成功。（3）PCR产物纯化。取10 μL PCR产物然后加5 U SAP酶和2 U核酸外切酶Ⅰ，在37℃恒温水浴锅中1 h，75℃15 min对酶进行灭活。（4）延伸反应。延伸过程共需10 μL，其中含有超纯水2 μL、SNaPshot Multiplex Kit（ABI）5 μL、多重PCR纯化后产物2 μL以及延伸引物混合物1 μL。延伸引物浓度：F+1为0.8 μmol/L、S2为0.8 μmol/L、ST+5为0.8 μmol/L、T1为0.5 μmol/L。延伸过程：变性96℃1 min；变性96℃10 s，退火55℃5 s，延伸60℃30 s，循环28次；4℃条件下保存。纯化延伸产物：取延伸产物10 μL并放入SAP酶1 U，在37℃恒温水浴锅中1 h，75℃对酶进行灭活15 min。（5）在ABI3730XL测序仪上对延伸产物进行测序。经过纯化的延伸产物0.5 μL、Liz120 SIZE STANDARD 0.5 μL、LHi-Di Formamide 9 μL，变性95℃5 min后进行测序。运用Gene-Mapper 4.1（Appliedbiosystems）软件对本实验结果进行分析。

1.3 统计学方法运用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料用表示，符合正态分布的计量资料2组间比较用两独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析。计数资料组间比较用χ2检验，采用基因计数法计算基因频率，Haploview软件分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律；组间基因型和等位基因频率分布的比较采用χ2检验，运用Phase软件进行单体型推断。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ADAM33基因F+1、S2、ST+5、T1位点测序结果F+1、ST+5、T1位点病例组及对照组共390个样本基因分型成功；S2位点病例组191个样本基因分型成功，6个样本基因分型失败，对照组190个样本基因分型成功，3个样本基因型分型失败。测序结果运用GeneMapper 4.1软件处理得出的各位点SNaPshot图像，见图1～4。

2.2 Hardy-Weinberg遗传平衡符合度检验F+1、S2、ST+5、T1位点基因型的分布符合与Hardy-Weinberg遗传平衡（P分别为0.680、0.700、0.591、1.000），选取的样本群体代表性良好。

2.32 组基因型以及等位基因频率分布的比较见表2。在病例组与对照组F+1位点基因型及等位基

因频率分布比较差异有统计学意义（P＜0.05），S2、ST+5、T1位点基因型以及等位基因频率分布的比较差异无统计学意义。

2.4 病例组ADAM33基因F+1位点各基因型与肺功能的关系病例组F+1位点各基因型的FEV1预计值和FEV1/FVC的比较差异无统计学意义，见表3。

Fig.1F+1 locus waveform and genotypes in ADAM33 gene图1 ADAM33基因F+1位点的波形和基因型

Fig.2S2 locus waveform and genotypes in ADAM33 gene图2 ADAM33基因S2位点的波形和基因型

Fig.3ST+5 locus waveform and genotypes in ADAM33 gene图3 ADAM33基因ST+5位点的波形和基因型

Fig.4T1 locus waveform and genotypes in ADAM33 gene图4 ADAM33基因T1位点的波形和基因型

Tab.2Comparison the gene frequency and allele frequency of F+1，S2，T1 and ST+5 locus between two groups表2 2组F+1、S2、T1、ST+5位点基因型以及等位基因分布频率的比较例（%）

Tab.3Relationship between ADAM33 genotypes and pulmonary function in case group表3 病例组ADAM33基因F+1位点基因型与肺功能指标的关系（%，）

Tab.3Relationship between ADAM33 genotypes and pulmonary function in case group表3 病例组ADAM33基因F+1位点基因型与肺功能指标的关系（%，）

均P＞0.05

基因型C C C T T T F n 9 5 7 3 2 9 F E V 1预计值6 0 . 7 8 ± 1 3 . 2 6 6 5 . 4 4 ± 1 6 . 6 0 6 0 . 2 4 ± 1 6 . 5 7 2 . 3 3 0 F E V 1 / F V C 6 2 . 9 5 ± 8 . 3 4 6 4 . 8 1 ± 7 . 7 3 6 5 . 1 0 ± 7 . 6 3 1 . 4 6 2

2.5 ADAM33基因位点单体型的分析F+1、S2位点有4种单体型，Hap1（CC）在对照组和病例组分布差异有统计学意义（P＜0.05），且OR＜1，此单体型可能降低发生COPD的风险；Hap3（TC）在对照组和病例组分布差异有统计学意义（P＜0.05），且OR＞1，此单体型可能增加了COPD发病的风险；Hap2（TG）、Hap4（CG）单体型在2组间分布差异无统计学意义，见表4。ST+5、T1位点3种单体型在2组间比较差异无统计学意义，见表5。

Tab.4Analysis of haplotype in F+1 and S2 locus in ADAM33 gene表4 ADAM33基因F+1、S2位点单体型的分析例（%）

Tab.5Analysis of haplotype in ST+5 and T1 locus表5 ADAM33基因ST+5、T1位点单体型的分析例（%）

3 讨论

ADAM33基因是ADAM家族的一员，主要表达于肺组织的成纤维细胞、平滑肌细胞以及支气管上皮细胞，与气道炎症、重塑及血管生成有关［2］，而气道炎症在气道重塑、胶原量增加以及瘢痕形成中发挥重要作用，这些也是导致气道狭窄的关键。气道狭窄、气道炎症及气流受限为COPD的病理基础，所以国内外专家开始对ADAM33基因与不同种族、不同国家COPD人群易感性之间的关系进行研究，但ADAM33基因在COPD的发病机制中的作用尚未明确。

目前ADAM33基因已经成为研究COPD易感性的热点基因。Shah等［3］通过对生活在克什米尔地区的COPD人群与ADAM33基因的关系进行了相关的研究，结果表明T1、T2位点GG基因型及Q-1位点AG基因型与COPD病程进展有关，T1、T2位点的G等位基因是当地人群患有此病的危险因素。Gosman等［4］对荷兰人群ADAM33基因多态性进行探究，得出的结论为T2、T1、S2、ST+5位点的基因型与COPD的发生有关，但Q-1、S1、F+1、V4位点与COPD并无相关性。Sadeghnejad等［5］对880例年龄在50岁以上并且有20年以上吸烟史的美国白种人群ADAM33基因多态性进行研究，结果为S2位点与肺功能指标降低以及COPD的发病进程有关。近些年，我国学者也开始关注此方面并对我国各民族人群进行研究。Tan等［6］运用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RELP）的方法对蒙古族人群ADAM33基因上8个位点的多态性进行检测，结果显示S2等位点与蒙古族COPD发病无明显关系。Xiao等［7］对我国藏族COPD人群进行研究，结果显示ADAM33基因T1位点的AG基因型与COPD易感性相关。根据以上研究显示ADAM33基因F+1、S2、ST+5、T1位点与COPD之间关系尚存在争议，因此F+1、S2、ST+5、T1位点与COPD易感性的关系仍有进一步探究的价值。

本课题组蒋涛等［8］对新疆哈萨克族COPD人群与ADAM33基因S1、V4位点之间的关系进行研究，发现V4及S1位点是COPD病程进展的影响因素。郝娥娥等［9］对新疆维吾尔族COPD人群与ADAM33基因S1、S2位点间的关系进行研究，但并未发现二者之间有关。本研究显示，ADAM33基因F+1位点的基因型以及等位基因的频率分布在新疆哈萨克族的病例组与对照组间比较差异有统计学意义，因此推测哈萨克族COPD易感性与F+1位点可能有关，但并未发现该位点和肺功能相关指标之间的关系；F+1、S2位点单体型分析显示，单体型Hap1（CC）在病例组的频率分布明显低于对照组，表明此单体型有降低发生COPD风险的可能性，单体型Hap3（TC）在病例组的频率分布明显高于对照组，因此该单体型增加了患COPD的风险，S2、ST+5、T1位点与新疆哈萨克族COPD人群的发病过程无关联。以上结果与其他国家及我国其他民族得出的结论存在差异，可能不同种族人群ADAM33基因各位点发挥的作用不同，也可能与生活环境有关，且ADAM33基因位点较多，各位点间存在连锁不平衡，并不能确定哪个位点起到决定性作用，应建立与疾病有关的完整基因体系。今后还需要深入研究，以进一步阐明COPD的遗传易感机制。

［1］Van Eerdewegh P，Little RD，Dupuis J，et al.Association of the ADAM33 gene with asthma and bronchial hyperresponsiveness［J］.Nature，2002，418（6896）:426-430.doi:10.1038/nature00878.

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polymorphism and susceptibility to chronic obstructive pulmonary disease in Xinjiang Kazak［J］.Chin J Tuberc Respir Dis，2013，36（11）:858-859.［蒋涛，关键，许西琳，等.ADAM33基因多态性与新疆哈萨克族慢性阻塞性肺疾病易感性研究［J］.中华结核和呼吸杂志，2013，36（11）:858-859］.

［9］Hao EE，Guan J，Xu XL，et al.Association between polymorphism of S1，S2 locus allele in ADAM33 gene and chronic obstructive pulmonary disease in Xinjiang Uygur Population［J］.Tianjin Med J，2015，43（3）:229-232.［郝娥娥，关键，许西琳，等.ADAM 33基因S1、S2位点单核苷酸多态性与新疆维吾尔族COPD易感性的关系［J］.天津医药，2015，43（3）:229-232］.doi:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.002.

（2015-07-27收稿 2015-09-01修回）

（本文编辑 李国琪）

Association between ADAM33 gene polymorphism with chronic obstructive pulmonary disease incidence in Kazakh of Xinjiang

WANG Shasha，GUAN Jian△，WANG Shan，CHENG Fangjuan，REN Xia，XU Xilin，GAO Yan
Department of Respiratory Medicine，The First Affiliated Hospital of Medical School，Shihezi University，Shihezi 832008，China△

ObjectiveTo explore correlation of Xinjiang Kazakh population who suffered from COPD with polymorphisms of F+1，S2，T1，ST+5 locus of ADAM33 gene.MethodsBlood samples（n=193）from healthy controls（Control group，n=193）and COPD patients（Case group，n=197）were detected by SNP SNaP shot.ResultsComparing case group with the control group，gene frequency and allele frequency of F+1 locus were of significant differences（P＜0.05）.In patient group，there were no significant differences in F+1 locus genotype and in clinical indicators include lung function FEV1 predicted and FEV1/FVC（P＞0.05）.The gene frequencies and allele frequency of S2、T1 and ST+5 locus were not significantly different between case group and control group（P＞0.05）.F+1 and S2 locus were analyzed by haplotype analysis which showed that there was significant differences in Hap1（CC）haplotype between case group and control group（P＜0.05），and OR＜1 indicated that its haplotype may reduce the risk of COPD.There were significant differences（P＜0.05）in Hap3（TC）haplotype between case group and control group and OR＞1 revealed that its haplotype may increase the risk of COPD.The distribution of Hap2（TG）and Hap4（CG）were not significantly different（P＞0.05）between the 2 groups.T1 and ST+5 locus were analyzed by haplotype analysis which showed significant differences in haplotypes between case group and control group（P＜0.05）.ConclusionThe occurrence of COPD may be related to the polymorphism of ADAM33 gene in F+1 locus in Xinjiang Kazakh.

pulmonary disease，chronic obstructive；ADAM proteins；polymorphism，single nucleotide；KAZAKH NATIONALITY；ADAM33 gene；haplotype

R563

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.002

国家自然科学基金资助项目（81360009）

石河子大学医学院第一附属医院呼吸内科（邮编832008）

王莎莎（1990），女，硕士研究生，主要从事呼吸系统疾病研究

△通讯作者E-mail:guanjian6@163.com