李雪磊，米盈盈，王秋红，匡海学

（黑龙江中医药大学北药基础与应用研究省部共建教育部重点实验室，

黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江哈尔滨150040）

酸性染料比色法测定雅连中总生物碱的含量

李雪磊，米盈盈，王秋红*，匡海学

（黑龙江中医药大学北药基础与应用研究省部共建教育部重点实验室，

黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江哈尔滨150040）

目的：测定雅连中总生物碱的含量，为其质量的控制提供实验依据。方法：以盐酸小檗碱为标准品，采用酸性染料比色法测定雅连总生物碱的含量。结果：盐酸小檗碱在44.7～178.8μg·mL-1内，回归方程为Y=1.7765χ+0.124，r=0.9991，吸光度与浓度具有良好的线性关系，平均回收率分别为100.35%，RSD=1.02%。结论：该方法准确度好，有一定的专属性，为雅连质量的控制提供实验依据。

雅连；总生物碱；酸性染料比色法

雅连为四川著名道地药材，来源于毛茛科植物三角叶黄连（Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao）的根茎，其味苦，寒，归心、脾、胃、肝、胆、大肠经，清热燥湿，泻火解毒。《本草纲目》记载“今虽吴蜀皆有，惟以雅州，眉州者良。”多用于湿热痞满，呕吐吞酸，泻痢，黄疸，高热神昏，心火亢盛，心烦不寐，血热吐衄，目赤，牙痛，消渴，痈肿疔疮；外治湿疹、湿疮，耳道流脓等疾病[1]，是一种被广泛应用的清热燥湿解毒药[2]。雅连根茎中分离出的主要成分为小檗碱等季胺型生物碱[3]及多糖等非生物碱成分，尚含有多种微量元素。其中生物碱类成分具有抗病菌，改善糖尿病等良好作用，具有很好的研究价值。但用酸性染料比色法测定雅连总生物碱尚未见报道。本实验采用酸性染料比色法测定雅连总生物碱含量，其准确，专属性较好，且对实验条件的要求较为严格[4]，为雅连质量的控制提供实验依据。

1 实验部分

1.1 仪器及试药

Specord 250 PLUS紫外可见分光光度计（德国耶拿分析仪器股份公司）；FE20型pH计（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；METTLER TOLEDO NewClassical MS天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

雅连药材（四川省眉山市洪雅县瓦屋山药业）；盐酸小檗碱对照品（成都普菲德生物技术有限公司，纯度≥98%）；溴甲酚绿（天津市致远化学试剂有限公司）；溴甲酚紫（天津市光复化工研究所）；溴百里香酚兰（天津市光复化工研究所）；枸橼酸（天津市东丽区天大化学试剂厂）；枸橼酸钠（天津市恒兴化学试剂制造有限公司）；磷酸氢二钠（天津市东丽区天大化学试剂厂）；甲醇（A.R.西陇化工股份有限公司）；水为蒸馏水，氯仿（A.R.）。

1.2 试验溶液的制备

1.2.1 对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的盐酸小檗碱对照品8.94mg，置于50mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为178.8μg· mL-1的对照品溶液。

1.2.1 供试品溶液的制备取干燥雅连粉末1g，置于干燥的100mL圆底烧瓶中，加入80%的乙醇50mL回流提取1h，抽滤，同法提取两次，合并滤液并定容于10mL容量瓶中，精密吸取1mL上述溶液，定溶于10mL容量瓶中加水至刻度，摇匀，既得供试品溶液。

2 方法与结果

2.1 测定条件的选择

2.1.1 酸性染料种类的选择精密吸取1.0mL蒸馏水，置于分液漏斗中，加入pH值为4.5的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液5.0mL，分别各取溴甲酚绿2.5mL、溴甲酚紫、溴百里香酚兰酸性染料溶液，摇匀，加入三氯甲烷10mL，振摇5min，静置30min，取三氯甲烷层，作为空白对照溶液组，进行全波长扫描。精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液1.0mL，置于分液漏斗中，加入pH值为4.5的5.0mL枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，分别各取2.5mL溴甲酚绿、溴甲酚紫、溴百里香酚兰酸性染料溶液，摇匀，加入三氯甲烷10mL，振摇5min，静置30min，取三氯甲烷层，作为离子对提取溶液组，进行全波长扫描。

根据结果可知，溴甲酚紫空白对照溶液在300～500nm范围内有较大吸光度，干扰较大；溴百里香酚兰与盐酸小檗碱形成的离子对在300～500nm范围内的最大吸光度最高，故酸性染料确定为溴百里香酚兰。

2.1.2 缓冲溶液的选择精密吸取1.0mL蒸馏水，置于分液漏斗中，分别加入pH值为4.5的5.0mL枸橼酸-磷酸二氢钠缓冲溶液、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液、乙酸-乙酸钠缓冲溶液，加入2.5mL溴百里香酚兰，摇匀，加入三氯甲烷10mL，振摇5min，静置30min，取三氯甲烷层，作为空白对照溶液组，分别进行全波长扫描。

精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液1.0mL，置于分液漏斗中，分别加入pH值为4.5的枸橼酸-磷酸二氢钠缓冲溶液5.0mL、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液、乙酸-乙酸钠缓冲溶液，加入溴百里香酚兰2.5mL，摇匀，加入三氯甲烷10mL，振摇5min，静置30min，取三氯甲烷层，作为离子对提取溶液组，分别进行全波长扫描。

根据结果可知，乙酸-乙酸钠缓冲溶液中空白对照溶液干扰较大；枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液中离子对吸光度最大，故缓冲溶液确定为枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液。

2.1.3 缓冲溶液pH值的选择精密吸取1.0mL盐酸小檗碱对照品溶液，加入pH值为3.5的5.0mL枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液溶，加入溴百里香酚兰2.5mL，摇匀，加入三氯甲烷10mL，振摇5min，静置30min，取三氯甲烷层在417nm波长下测定吸光值。同方法测定pH值4.0、4.5、5.0、5.5时的吸光值。

根据结果可知，pH值为4.5时离子对吸光度最大，离子对吸光度最大故缓冲溶液pH值确定为4.5。2.1.4酸性染料用量的选择精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液1mL，置于分液漏斗中，加入pH值为4.5的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液5.0mL，分别各取2.5mL溴百里香酚兰酸性染料溶液，摇匀，加入三氯甲烷10mL，振摇5min，静置30min，取三氯甲烷层在417 nm波长下测定吸光值。同法测酸性染料量为1.5、2.0、2.5、3.0mL时的吸光值。

根据结果可知，酸性染料用量为2.5mL时离子对吸光度最大，故酸性染料用量定为2.5mL。

2.1.5 测定波长的选择根据2.2.1及2.2.2分析得出波长为417nm时有最大吸收峰，故波长的选择为417nm。

2.1.6 总生物碱的测定精密吸取对照品溶液0.25、0.4、0.55、0.7、0.85、1.0mL加入甲醇至1.0mL，按测定方法进行测定，在417nm处测定吸收度，以对照品浓度为横坐标，吸收度为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=1.7765χ+0.124，r=0.9991.结果表明盐酸小檗碱在44.7～178.8μg·mL-1的范围内具有良好的线性关系。

2.2 酸性染料比色法的方法学考察

2.2.1 精密度实验精密量取对照液1.0mL，置于分液漏斗中，加入pH值为4.5的5.0mL枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，取溴百里香酚兰酸性染料溶液2.5mL，摇匀，加入三氯甲烷10mL，振摇5min，静置30min，取三氯甲烷层在417nm波长下测定吸光值，连续测定6次。测得RSD=1.74%，说明仪器所测数据准确可靠。

2.2.2 样品稳定性实验精密吸取生雅连供试品溶液和酒黄连供试品溶液1.0mL，加入pH值为4.5的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液5.0mL，取溴百里香酚兰酸性染料溶液2.5mL，摇匀，加入三氯甲烷10mL，振摇5min，静置30min，取三氯甲烷层在417 nm波长下测定吸光值，每间隔0.5h在417nm处测定吸收度。测得RSD为1.31%,表明其在2h内稳定。

2.2.3 加样回收率实验精密吸取6份已知浓度的供试品溶液各0.5mL，分别精密加入盐酸小檗碱对照品溶液0.2、0.3、0.4mL对照品溶液，加甲醇稀释至1.0mL，混匀，按以上方法比色测定吸光度。根据回归方程计算回收率，结果见表1。

表1 雅连总生物碱回收率Tab.1 The results of recovery test

2.2.4 样品含量测定精密称取干燥雅连粉末1g，按1.2.1项下制备样品供试液。精密吸取样品供试液1mL，加入pH值为4.5的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液5.0mL，取溴百里香酚兰酸性染料溶液2.5mL，摇匀，加入三氯甲烷10mL，振摇5min，静置30min，取三氯甲烷层在417 nm波长下测定吸光值，根据标准曲线计算雅连总生物碱的含量，得出雅连总生物碱含量分别为0.1489g·g-1。

3 结论

酸性染料比色法是生物碱类与氢离子生成阳离子，酸性染料与其定量结合成有色络合物，被有机溶剂提取，在一定的波长处测定其吸收度，即可计算出总生物碱的含量[5]。酸性染料比色法所测定的结果较为准确，近年来应用较多[6]。

本文对酸性染料的种类及用量、检测波长、缓冲液pH值、缓冲液的选择等多个实验条件进行了优化筛选，找到最佳条件。该方法具有一定的专属性和准确度，灵敏度高，简便易行[7]，适用于雅连总生物碱含量的测定，用于其质量的控制。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［S］.北京：化学工业出版社,2010，282

［2］徐锦堂,王立群,徐蓓.黄连研究进展［J］.中国医学科学院学报,2004,26（6）:704-705

［3］黄小平,李隆云,瞿显有,等.石柱黄连指纹图谱研究［J］.中药材, 2006,29（7）:666.

［4］杜萌,刘璇,丁安伟,等.酸性染料比色法测定百合中总生物碱的含量［J］.江苏中医药,2012,449（1）:62-63.

［5］石雪萍,张宇思.酸性染料比色法测定花椒总生物碱的含量［J］.中国野生植物资源,2008,27（6）:62-64．

［6］刘喜纲,刘翠哲,常金花.应用酸性染料比色法测定总生物碱的含量［J］.中国药房，2007，18（11）：875-876．

［7］汪怡.酸性染料比色法测定黄连解毒汤中总生物碱的含量［J］.安徽医药,2013,17（5）：759-762.

表4 不同混合时间药桨粘度Tab.4 Viscosity of slurry with different mixing time

由表4可以看出，随着混合时间延长，药桨粘度不断增加。这是因为混合时间越长，陶粒的酸解程度加大，导致药桨粘度增大。

3 结论

（1）陶粒添加到复合推进剂中后，会产生一定程度的酸解，导致药桨粘度增大。相同密度条件下陶粒粒径越小，酸溶解度越高，药桨粘度越大。陶粒密度差异对药桨粘度影响不大。

（2）陶粒添加比例增大，复合推进剂体系的固含量上升，药桨粘度增大。

参考文献

［1］陈东波，徐刚，苏鹏，等.复合射孔工艺在塔河油田的应用［J］.长江大学学报（自然版），2014，11（14）:50-58.

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［4］SY/T6824-2011.油气井用复合射孔器通用技术条件及检测方法［S］.

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Determination of total alkaloids in coptidis deltoideae by acid dye colorimetry

LI Xue-lei，MI Ying-ying，WANG Qiu-hong，KUANG Hai-xue
（Key Laboratory of Chinese Materia Medica（Ministry of Education），Hei Long Jiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

Objectiue：To determine total alkaloids in coptidis deltoideae,which can be used for quality control. Methods:Berberine hydrochloride was used as a control standard.The contents of total alkaloids were determined by acid dye colorimetry.Results:The linear range of berberine hydrochloride was 44.7～178.8μg·mL-1,the regression equation was Y=1.7765χ+0.124,r=0.9991.The average recovery was 100.35%,and RSD was 1.02%.Conclusion:This method is accurate with good reproducibility,which can be used for quality control.

coptidis deltoideae；total alkaloids；acid dye colorimetry

R927.2

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20151229

2015-08-31

李雪磊（1990-），女，黑龙江牡丹江人，在读研究生，从事中药药效物质基础及其作用机制研究。

王秋红，教授，从事中药及天然药物药效物质基础、中药性味理论研。