李宏敏安宁于瑞莲何阳科邓红彬

·临床研究与应用·

PKM2基因在非小细胞肺癌中表达及其与放疗敏感性的关系

李宏敏①安宁①于瑞莲①何阳科①邓红彬②

目的：研究PKM2在非小细胞肺癌组织中的表达及其与放疗敏感性的关系。方法：选取2011年5月至2013年10月四川省人民医院非小细胞肺癌120例患者，术后进行2个月的放射治疗，按照疗效将患者分为4组。RT-PCR检测患者放疗前手术切除的肿瘤组织和癌旁组织中PKM2 mRNA表达水平。Western blot和免疫组织化学检测肿瘤组织和癌旁组织中PKM2蛋白表达。RT-PCR和Western blot方法检测不同疗效组PKM2表达水平。结果：非小细胞肺癌放疗2个月后，治疗有效率为49.2%。PKM2在非小细胞肺癌癌组织中表达显著高于相应的癌旁组织。PKM2表达水平与患者放疗疗效呈负相关。结论：PKM2在非小细胞肺癌中表达高于癌旁组织，PKM2低表达患者对放疗敏感性高。

非小细胞肺癌 PKM2 放疗敏感性

肺癌是近年来全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其发病率的上升速度也是恶性肿瘤中最高的。肺癌中约85%为非小细胞肺癌（NSCLC）［1］，其发病率在肺癌中居首位［2］，患者5年内生存率不足15%［3］。NSCLC作为放疗中度敏感的恶性肿瘤之一，放射治疗是其主要治疗手段，约70%非小细胞肺癌患者需要接受放射治疗［4］，一些NSCLC患者对放射疗法不敏感，这成为治疗最为重要的挑战［5］。丙酮酸激酶（PK）是有氧糖酵解途径的关键限速酶之一，PKM2是PK的一种异构体，与肿瘤的发生发展密切相关，并且在很多肿瘤的诊断、预后及治疗方面有良好的临床应用价值［6］，可作为恶性肿瘤患者的独立预后因素。研究表明，PKM2低表达的结肠癌细胞对奥沙利铂化疗耐药性增加［7］，并且敲减PKM2的表达可增强肺癌细胞化疗敏感性［8］，可将其作为肿瘤治疗的重要靶点。研究表明，PKM2可作为晚期非小细胞肺癌患者对铂类化合物化疗敏感性的预测生物学标记物［9］，因放射疗法是NSCLC的主要治疗手段，本研究旨在研究PKM2在NSCLC中的表达及与放疗敏感性关系。

1 材料与方法

1.1材料

选取120例四川省人民医院院2011年5月至

2013年10月确诊的非小细胞肺癌120例患者作为试验组，其中男性67例，女性53例，年龄4～76岁，平均年龄56.3岁。所有患者临床资料齐全，未发生远处转移，心肺功能正常，均未接受放化疗。

1.2方法

1.2.1治疗方案所有患者术后2～4周均接受三维适形放射治疗，2 Gy/次，5次/周，治疗总剂量达50～70 Gy，进行为期8周的放射治疗。根据WHO肿瘤疗效评价标准判定疗效，将患者分组为完全缓解组（CR）、部分缓解组（PR）、稳定组（NC）和进展组（PD），有效率（RR）=CR+PR。

1.2.2组织RNA的提取放疗前对手术切除的肿瘤组织样本和相应的癌旁组织样本，采用Qiagen组织RNA提取试剂盒（德国）进行组织RNA的提取。通过紫外分光光度计测定A260/A280后，计算RNA浓度，采用DEPC水调节所提的RNA至相同浓度。

1.2.3RT-PCR测定非小细胞肺癌及癌旁组织PKM2 mRNA表达美国Promega公司逆转录试剂盒将组织总RNA反转成cDNA后，用TaqMan Gene Expression Assays（美国Applied Biosystems公司）检测PKM2 mRNA的表达水平。PKM2基因上游引物：5'-GGGAGCCACTCT CAAAATCA-3'；下游引物：5'-ACCTTTTCTGCTTC ACCTGGA-3'。内参GAPDH上游引物：5'-TCAGTGGTG GACCTGACCTG-3'；下游引物：5'-TGCTGTAGC CAAATTCGTTG-3'。反应条件：94℃，5mim；60℃，30s；40个循环。

1.2.4Western blot检测非小细胞肺癌及癌旁组织PKM2蛋白表达随机选取4例非小细胞肺癌患者放疗前手术切除的肿瘤组织样本和相应的癌旁组织，采用Qiagen组织提取试剂盒进行组织总蛋白的提取。SDS-PAGE凝胶电泳分离，恒流300 mA转移至PVDF膜。5%脱脂牛奶封闭2 h后，加入一抗（PKM2抗体购自美国Abcam公司），4℃孵育过夜。次日PBST洗膜，二抗室温孵育2 h，PBST洗膜。用化学发光法显色，凝胶成像系统采集成像。

1.2.5免疫组织化学分析NSCLC及癌旁组织PKM2表达取患者放疗前手术切除的肿瘤组织样本和相应的癌旁组织，用10%甲醛固定4 h后石蜡包埋，切片5 μm厚度，脱蜡水化后用过氧化氢处理20 min，进行抗原修复，用PKM2抗体（购自美国Abcam公司）孵育过夜，PBS洗涤后二抗孵育40 min，DAB显色，复染，封片。阳性表达判断标准，每例随机技术10个（×400）视野，以镜下阳性细胞百分比和染色强度进行半定量评价。1）着色细胞数占细胞计数百分比＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。2）无染色为0分，染色强度淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两者相乘即阳性等级：0分为阴性，1～4分为弱阳性（+），5～8分为阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。

1.3统计学分析

2 结果

2.1放疗疗效

8周放射治疗后，120例患者中CR为24例，PR为35例，NC为37例，PD为24例，有效率（RR）为49.2%（59/120）。

2.2非小细胞肺癌及癌旁组织PKM2 mRNA、PKM2蛋白表达差异

通过RT-PCR分析，120例NSCLC患者放疗前的癌组织中PKM2 mRNA表达的阳性率为70.8%（85/ 120），与对应的癌旁组织PKM2 mRNA表达的阳性率6.67%（8/120）相比，差异有统计学意义（P＜0.000 1），实时荧光定量PCR检测结果显示，癌组织中PKM2的表达与β-actin比值为6.24，癌旁组织PKM2的表达与β-actin比值为0.38（表1，图1）。4例NSCLC患者Western blot结果显示，癌组织样本中PKM2高表达，对应的癌旁组织中PKM2表达量较低，几乎不表达，见图2。

表1 非小细胞肺癌及癌旁组织PKM2 mRNA表达差异Table 1Expression levels of PKM2 mRNA in tumor and normal tissues

2.4免疫组织化学检测非小细胞肺癌及癌旁组织PKM2表达差异

免疫组织化学结果显示（图3），PKM2在非小细胞肺癌组织中表达情况为40例（-）、8例（+）、48例（++）、24例（+++），阳性率为66.7%（80/120），并且在细胞核及细胞质均有表达，而在癌旁组织中只在细胞质里有微量表达，见图3，表达情况为104例（-）、12例（+）、4例（++）、0例（+++），阳性率为13.3%（16/ 120），差异有统计学意义（P＜0.001）。

图1 非小细胞肺癌及癌旁组织PKM2 mRNA表达差异Figure 1Expression levels of PKM2 mRNA in tumor and normal tissues

图2 非小细胞肺癌及癌旁组织PKM2蛋白表达差异Figure 2Expression levels of PKM2 protein in tumor and normal tissues

图3 非小细胞肺癌及癌旁组织PKM2表达检测（DAB×40）Figure 3Expression levels of PKM2 in tumor and normal tissues（DAB×40）

2.5RT-PCR测定不同放疗疗效组治疗前肿瘤样本PKM2 mRNA表达差异

RT-PCR结果显示，放射治疗前，与所有患者PKM2 mRNA表达的均值6.24±0.27相比，疗效最好的CR组在治疗前，PKM2 mRNA表达水平最低3.05±0.21，而放疗无效组（NC/PD）PKM2 mRNA的表达量较高，PKM2 mRNA水平与放疗疗效呈负相关（表2，图4）。

▶*.compared with the former group P＜0.01图4不同放疗疗效组治疗前肿瘤样本PKM2 mRNA表达Figure 4Expression levels of PKM2 mRNA in tumor tissues in different groups before radiotherapy

2.6不同放疗疗效组治疗前肿瘤样本PKM2蛋白表达差异

通过Western blot分析，疗效最好的CR组在治疗前PKM2蛋白表达水平最低，而放疗无效组（NC/PD）PKM2蛋白的表达量较高，PKM2蛋白水平与放疗疗效呈负相关，这与mRNA检测结果相一致，说明低表达的PKM2患者对放射疗法更敏感（图5）。

2.7不同放疗疗效组治疗前肿瘤样本PKM2免疫组织化学阳性率差异

本研究统计了放疗前不同疗效组肿瘤样本免疫组织化学PKM2表达的阳性率。结果显示，与所有患者PKM2表达阳性率（66.7%）相比，疗效最好的CR组在治疗前PKM2表达的阳性率最低（45.8%），而放疗无效组（NC/PD）PKM2表达的阳性率较高，PKM2在非小细胞肺癌中表达的阳性率与放疗疗效呈负相关（表3）。

表2 不同放疗疗效组治疗前肿瘤样本PKM2 mRNA表达Table 2Expression levels of PKM2 mRNA of tumor tissues in different groups before radiotherapy

图5 不同疗效组治疗前肿瘤样本PKM2蛋白表达Figure 5Expression levels of PKM2 protein of tumor tissues in different groups before radiotherapy

3 讨论

糖代谢异常是肿瘤细胞的重要特点之一，无论是否有氧气存在，肿瘤细胞都依赖糖酵解进行代谢，即Warburg效应。M2型丙酮酸激酶PKM2是Warburg效应中一个关键的限速酶，在肿瘤中表达量较高［10］。研究表明，PKM2高表达能够通过增强Warburg效应而促进肿瘤生长［11］，恶性肿瘤患者血清中PKM2的表达水平显著升高，并与肿瘤的分化转移和分期有关［12］，且治疗有效时其浓度下降，可以将其作为恶性肿瘤诊断和预后预测的重要指标［6］。肺癌是目前全球范围内恶性肿瘤之一，我国肺癌的发病率和死亡率居所有癌症的首位，非小细胞肺癌是最常见的肺癌类型，也是肺癌治疗的重点［13］。放疗是其重要的临床治疗手段，但不同个体对肿瘤的放疗敏感性不同，相同放射剂量下有的患者治疗无效，会导致延误病情，若能在治疗前预测患者放疗敏感性则可对不同患者进行个性化治疗［14］。研究表明PKM2可作为晚期非小细胞肺癌患者对铂类化合物化疗敏感性的预测生物学标记［9］，但目前关于PKM2与非小细胞肺癌放疗敏感性相关报道较少。

为验证PKM2在非小细胞肺癌中的表达，本研究首先检测了120例非小细胞肺癌患者癌组织和癌旁组织中PKM2 mRNA以及蛋白表达水平。结果显示，PKM2在癌组织中普遍高表达，而在癌旁组织中表达量较低几乎不表达，这与之前在其他肿瘤中PKM2表达上调的报道相一致，并且免疫组织化学的结果显示，PKM2在癌旁组织细胞质中只有轻微表达，而在肺癌组织细胞核和胞浆均有表达，说明PKM2在非小细胞肺癌发展过程中会发生由细胞质向细胞核的转移，这与之前在多种肿瘤中发现的PKM2向细胞核转移的报道相符［15］。提示PKM2在非小细胞肺癌的发生发展及病情预示中可能发挥着重要作用。

本研究分别检测了不同放疗疗效组在接受治疗前其癌组织中PKM2的表达水平，研究PKM2与非小细胞肺癌放疗敏感性的关系，结果显示，放疗疗效最好的CR组肿瘤组织中PKM2的表达水平较其他组低，其他疗效组PKM2的表达水平也随着疗效的降低而增加，提示PKM2的表达水平与患者对放射线的敏感性密切相关，即PKM2表达水平低的患者，对放射线较为敏感，放疗疗效和预后良好。在对采取标准手术治疗、放化疗的55例胶质母细胞瘤患者预后统计中发现，PKM2表达较低的患者中位生存期为34.5个月，相比之下具有高水平PKM2的患者中位生存期仅为13.6个月［16］。这与本研究的疗效好的治疗组患者PKM2表达水平低的结果相符。分析其潜在的机制，研究发现沉默PKM2的表达会降低前列腺癌细胞PC2中cyclin D1和c-myc基因的表达［17］，cyclin D1和c-myc是重要的细胞周期调控蛋白，对肿瘤的发生发展起着重要作用，因此推测，PKM2表达量低的肿瘤细胞中，cyclin D1和c-myc表达量受到限制，导致细胞增长减慢，对于同样的放射剂量，其细胞凋亡的比例明显高于细胞增殖，使其对放射线敏感性提高；而在PKM2高表达的肿瘤细胞中，cyclin D1和c-myc表达升高，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，对于同样的放射剂量，相对于PKM2低表达的肿瘤细胞，其细胞凋亡的比例明显降低，导致其对放射线敏感性降低。

综上所述，PKM2在非小细胞肺癌的肿瘤组织中表达上调并发生由细胞质向细胞核转移，且其表达水平与患者对放射线的敏感性呈负相关，可以将其作为预测放疗疗效的重要指标，但PKM2向细胞核转移以及增强放疗敏感性的具体机制有待在细胞水平上进行相关基因表达验证，以及PKM2免疫荧光及敲减等进一步实验研究。能否将其作为非小细胞肺癌治疗的重要靶点也有待进一步的探索，期望将PKM2作为对非小细胞肺癌放疗疗效的重要预测指标，实现非小细胞肺癌患者的个性化治疗。

［1］Zhao ZZ，Wang ZM，Mao AW.Current situation of intervention⁃al treatment for non-small lung cancer［J］，J Intervent Ratiol，2014，23（3）：272-276.［赵真真，王忠敏，茅爱武.非小细胞肺癌的介入治疗现状［J］.介入放射学杂志，2014，23（3）：272-276］.

［2］Komaki R，Tsao AS，Mehran RJ.Non-Small Cell Lung Cancer［M］.Springer New York，2013：45-62.

［3］Zhang X，Wang J.Epidermal grouth factor receptor mutation and radiotherapy innon-small cell lung cancer［J］.Chinese Journal of

Cancer，2013，16（3）：157-161.［钟幸，王瑾.EGFR突变与非小细胞肺癌放射治疗进展［J］.中国肺癌杂志，2013，16（3）：157-161.］

［4］Bradley JD，Paulus R，Komaki R，et al.A randomized phase III comparison of standard-dose（60 Gy）versus high-dose（74 Gy）conformal chemoradiotherapy with or without cetuximab for stage III non-small cell lung cancer：Results on radiation dose in RTOG 0617［J］.J Clin Oncol，2013，31（15）：7501.

［5］Wang XC，Du LQ，Tian LL，et al.Expression and function of miRNA in postoperative radiotherapy sensitive and resistant patients of non-small cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2011，72（1）：92-99.［6］Yi CX，Zhou FF，Xia LP.The diagnostic and progostic value of Serum PKM2 in patients with cancer［J］.Journal of Chinese On⁃cology，2013，19（7）：565-569.［尹晨希，周菲菲，夏良平.恶性肿瘤患者血清中PKM2水平的诊断和预后预测价值［J］.肿瘤学杂志，2013，19（7）：565-569.］

［7］Martinez-Balibrea E，Plasencia C，Ginés A，et al.A proteomic ap⁃proach links decreased pyruvate kinase M2 expression to oxalipl⁃atin resistance in patients with colorectal cancer and in human cell lines［J］.Molecular Cancer Therapeutics，2009，8（4）：771-778.

［8］Shi HS，Li D，Zhang HL，et al.Silencing of pkm2 increases the ef⁃ficacy of docetaxel in human lung cancer xenografts in mice［J］. Cancer Science，2010，101（6）：1447-1453.

［9］Papadaki C，Sfakianaki M，Lagoudaki E，et al.PKM2 as a bio⁃marker for chemosensitivity to front-line platinum-based che⁃motherapy in patients with metastatic non-small-cell lung can⁃cer［J］.Br J Cancer，2014，111（9）：1757-1764.

［10］Chaneton B，Gottlieb E."Rocking cell metabolism：revised func⁃tions of the key glycolytic regulator PKM2 in cancer［J］.Trends Biochemi Sci，2012，37（8）：309-316.

［11］Mazurek S，Boschek CB，Hugo F，et al.Pyruvate kinase type M2 and its role in tumor growth and spreading［J］.Semina Cancer Bi⁃ol，2005，15（4）：300-308.

［12］Zhan C，Shi Y，Wang Q.Application of M2-type pyruvate ki⁃nase in cancer diagnosis and therapy［J］.Chinese Journal of Can⁃ cer Prevention and Treatment，2013，20（13）：1043-1045.［詹成，时雨，王群.丙酮酸激酶M2型应用于肿瘤诊断与治疗的研究进展［J］.中华肿瘤防治杂志，2013，20（13）：1043-1045.］

［13］Wang M，Wang CL.Development of molecular-targeted thera⁃py for non-small cell lung cancer［J］.Chin J Clin Oncol，2011，38（15）：927-929.［王勐，王长利.非小细胞肺癌的分子靶向治疗进展［J］.中国肿瘤临床，2011，38（15）：927-929.］

［14］Cui SS.The different miRNA expression profile of radiotherapy sensitive and resistant patient of non-small cell lung cancer［J］. Chinese Peking Union Medical College，2013，19（7）：565-569.［崔爽爽.MicroRNA表达与非小细胞肺癌放疗敏感性关系的研究［J］.中国协和医科大学学报，2013，19（7）：565-569.］

［15］Zhan C，Shi Y，Ma J，et al.A review of the mechanism of pyruvate kinase M2′s nuclear translocation and its function in nucleus［J］. Fudan University Journal of Medical Sciences，2014，41（1）：133-136.［詹成，时雨，马军，等.丙酮酸激酶M2型（PKM2）入核机制和核内作用的研究进展［J］.复旦学报（医学版），2014，41（1）：133-136］.

［16］Yang W，Xia Y，Can Y，et al.EGFR-Induced and PKC Monou⁃biquitylation-Dependent NF-B Activation Upregulates PKM2 Expression and Promotes Tumorigenesis［J］.Molecular Cell，2012，48（5）：771-784.

［17］Lu L，Wang L，Jiang GS，et al.Silencing pyruvate kinase M2 sen⁃sitize human prostate cancer PC3 cells to gambogic acid-in⁃duced apoptosis［J］.Natl J Androl，2013，9（2）：102-106.［吕磊，汪良，蒋国松，等.沉默PKM2增强藤黄酸诱导人前列腺癌PC3细胞凋亡的敏感性［J］.中国男科学杂志，2013，19（2）：102-106.］

（2015-01-08收稿）

（2015-03-03修回）

（编辑：杨红欣）

Expression of pyruvate kinase M2 in non-small cell lung cancer and its correlation with radiation sensitivity

Hongmin LI1，NingAN1，Ruilian YU1，Yangke HE1，Hongbin DENG2

Hongbin DENG；E-mail：hongbindeng_2014@126.com

Objective：To investigate the expression level of pyruvate kinase M2（PKM2）in tissues of non-small cell lung cancer（NSCLC）patients and the correlation between PKM2 expression level and radiation sensitivity.Methods：A total of 45 NSCLC patients were chosen and treated with radiotherapy for two months after surgery.The patients were classified into four groups based on the curative effect.The mRNA expression levels of PKM2 in tumor and the homologous paraneoplastic tissues of NSCLC patients were detected prior to radiotherapy using real time-polymerase chain reaction（RT-PCR），and the protein expressions of PKM2 in the tumor and paraneoplastic tissues of NSCLC patients were detected with Western blot analysis and immunohistochemical method.The mRNA and protein expression levels of PKM2 in the tumor tissues of different groups were detected with RT-PCR and Western blot assays.Results：The effective rate of radiotherapy for 2 months is 44.8%in NSCLC patients.The expression level of PKM2 is significantly higher in tumor tissues than in homologous paraneoplastic tissues of NSCLC patients and is negatively correlated with the curative effect of radiotherapy.Conclusion：The expression level of PKM2 is significantly higher in tumor tissues than in the paraneoplastic tissues of NSCLC patients.Patients with lower PKM2 expression level are more sensitive to radiotherapy.

non-small cell lung cancer，PKM2，radiation sensitivity

10.3969/j.issn.1000-8179.20150041

①四川省人民医院肿瘤科（成都市610072）；②重庆医科大学附属第一医院肿瘤科

邓红彬hongbindeng_2014@126.com

1Department of Oncology，Sichuan Provincial People's Hospital，Chendu 610072，China；2Department of Oncology，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China

李宏敏专业方向为肿瘤的综合治疗。

E-mail：wxy_0010@163.com