董静，李晶，刘斌，毛文静，张晋霞，李世英

养血清脑颗粒对血管性痴呆大鼠海马CA1区胶质纤维酸性蛋白表达的影响①

董静1a，李晶1b，刘斌1b，毛文静1b，张晋霞1b，李世英1b

目的观察养血清脑颗粒对血管性痴呆大鼠海马CA1区胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响。方法144只Sprague-Daw ley大鼠随机分为假手术组(n=48)、血管性痴呆模型组(模型组，n=48)和养血清脑颗粒治疗组(治疗组，n=48)。采用改良Pulsinelli四血管阻断法制作血管性痴呆大鼠模型。假手术组和模型组灌胃生理盐水10m l/(kg·d)；治疗组灌胃养血清脑颗粒3.2 g/(kg·d)。分别在术后1周、2周、4周和8周采用免疫组化法和Western blotting法检测海马CA1区GFAP表达水平。结果与对照组比较，模型组各时间点大鼠海马CA1区GFAP表达明显增高(P＜0.01)；与模型组比较，治疗组各时间点GFAP表达明显下降(P＜ 0.01)。结论养血清脑颗粒可抑制血管性痴呆大鼠海马CA1区星形胶质细胞的增生和活化。

血管性痴呆；星形胶质细胞；胶质纤维酸性蛋白；养血清脑颗粒；大鼠

[本文著录格式] 董静，李晶，刘斌，等.养血清脑颗粒对血管性痴呆大鼠海马CA1区胶质纤维酸性蛋白表达的影响[J].中国康复理论与实践,2015,21(12):1375-1378.

CITED AS:Dong J,Li J,Liu B,etal.Effectof Yangxue Qingnao granule on expression of glial fibrillary acidic protein in CA1 area of hippocampus in ratswith vasculardementia[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(12):1375-1378.

血管性痴呆(vascular dementia,VD)是发生在脑血管疾病基础上的以记忆、认知功能缺损为主，或伴有语言、视觉空间技能及情感或人格障碍的获得性智力持续性损害[1]。血管性痴呆的发病机制尚未完全明确，但研究表明，星形胶质细胞(astrocytes)在血管性痴呆的发生、发展过程中具有重要意义[2-3]。胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是星形胶质细胞的特征性标记物[4]，其表达可反映星形胶质细胞的增生与活化情况。

养血清脑颗粒是根据中医药传统理论，以中医传统名方四物汤为基础改良而成的中药复方制剂，具有滋阴养血、平肝潜阳、活血通络的功效，临床上应用养血清脑颗粒能明显改善血管性痴呆患者认知功能和日常生活能力[5]，但其具体作用机制尚不明确。因此，本研究通过观察养血清脑颗粒对血管性痴呆大鼠海马CA1区GFAP表达的影响，探讨养血清脑颗粒治疗血管性痴呆的可能机理。

1　材料与方法

1.1动物

健康雄性Sprague-Daw ley大鼠144只，体质量250～280 g，3月龄，由北京华阜康生物科技股份有限公司供给，合格证号SCXK(京)2013-0013。在华北理工大学屏障环境动物实验室自由进食喂养，室温控制在(23±2)℃，相对湿度45%～55%，早上7点到晚上7点开灯，12 h明暗交替光照，实验前适应喂养2周。

1.2试剂和仪器

养血清脑颗粒，国药准字Z10960082，批号130366，规格4 g/袋：天津天士力制药股份有限公司。兔抗大鼠GFAP抗体，货号bs-4989R，批号150419：北京博奥森生物公司。DAB显色液，货号ZLI-9018，批号K143313B：北京中杉生物有限公司。

L-420型低速离心机：美国SIGMA公司。FGD-8AB型电凝仪：张家港航天医疗电器有限公司。KD-2800型切片机：上海亿欣生物科技有限公司。H-7650型透射电子显微镜：日本HITACHI公司。

1.3方法

1.3.1动物分组

将大鼠编号，用随机数生成器随机抽取不同数字，将大鼠随机分为假手术组(n=48)、血管性痴呆模型组(模型组，n=48)和养血清脑颗粒治疗组(治疗组，n=48)，在模型制备成功后又随机分为造模术后1周、2周、4周和8周4个亚组，每个亚组12只。

1.3.2模型制备

采用改良Pulsinelli四血管阻断法制作血管性痴呆大鼠模型[6]。术前12 h禁食，用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉后，背侧行颈正中切口以暴露双侧第一颈椎横突小孔，接着将直径0.5mm的电凝针插入双侧翼小孔烧灼双侧椎动脉，造成双侧永久性闭塞。然后将大鼠仰卧位固定，行腹侧颈正中切口，分离双侧颈总动脉，以4号丝线穿线。于24 h后用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉5m in，共夹闭3次，每次间隔1 h。术后手术部位喷洒庆大霉素抗感染，然后缝合切口，继续常规饲养观察。

假手术组大鼠操作步骤同上，但不烧灼和夹闭血管。

术后各组大鼠均给予庆大霉素1×104U/kg腹腔注射，连续3 d。

1.3.3给药

三组均灌胃给药，每天1次。假手术组：大鼠双侧颈总动脉分离后，不做缺血处理，给予生理盐水10m l/(kg·d)灌胃。模型组：模型制备成功后，给予生理盐水10m l/(kg·d)灌胃。治疗组：模型制备成功后，参照陶涛等[7]的方法，将养血清脑颗粒用蒸馏水配置成混悬液，浓度为0.32 g/m l，灌胃养血清脑颗粒10m l/(kg·d)。

1.3.4免疫组化检测

大鼠喂养至各个时相点后，每个亚组取6只，用10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后暴露心脏，经左心室快速灌注盐水100m l，持续灌注4%多聚甲醛-PBS 100m l，断头取脑，4%多聚甲醛-PBS固定过夜，冠状面切断包含海马的脑组织(视交叉后)，石蜡包埋，5μm连续切片，SP法进行免疫组织化学染色。切片常规脱蜡至水，加入正常羊血清封闭液中，先后滴加一抗4℃过夜、滴加二抗和适量辣根酶标记链霉卵白素工作液，进行DAB显色。免疫组化方法具体操作步骤按试剂说明书操作要求进行。

GFAP免疫组化阳性标准：光学显微镜下，细胞胞浆和胞核均呈棕黄色。组织切片采用OLYMPUS摄像显微镜(400×)摄像，选择各组大鼠海马CA1区不重叠的6个视野，应用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统分别进行GFAP阳性细胞计数。

1.3.5Western blotting检测

大鼠喂养至各个时相点后，每个亚组取6只，以脊髓脱臼法处死大鼠后立即断头于冰上取脑，将取出的海马组织置于15m l离心管中，加入组织裂解液，作用30m in后用组织匀浆机12000 r/m in匀浆，并将细胞悬液放入4℃低温离心机中12000 r/m in离心10 m in，留取上清液-80℃保存。将蛋白定量后分装，用PBS调蛋白浓度到一致(800μg/m l)，加入等体积的上样缓冲液，沸水中煮至少5m in。冷却至室温，放入4℃冰箱备用。各组取组织20μg，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸铵凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳分离后，以湿转法电转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上。转移后的PVDF膜放入封闭液中封闭，然后分别加入稀释好的兔抗大鼠GFAP一抗(1∶1000)，4℃孵育过夜。PBS洗膜，加入相应稀释好的二抗(羊抗兔，1∶2000)，37℃反应1 h，洗膜，以ECL显色，胶片曝光显影，使用Image J软件进行平均灰度值测定。

1.4统计学分析

2　结果

2.1免疫组化

假手术组各时间点大鼠海马CA1区可见少量GFAP表达；模型组各时间点GFAP表达明显增多，1周时即有多量表达，2周时大量表达，4周时达高峰，8周时开始下降但仍较高。与假手术组相比，模型组各时间点GFAP表达明显增多(P＜0.01)。与模型组比较，治疗组各时间点GFAP表达明显减少(P＜0.01)。见表1和图1。

表1　各组不同时间点大鼠海马CA1区GFAP表达(个/高倍视野)

图1　各组不同时间点大鼠海马CA1区GFAP表达(免疫组化染色，400×)

2.2Western blotting检测

假手术组各时间点大鼠海马CA1区可见少量GFAP表达，模型组各时间点GFAP表达明显增多，1周时即有多量表达，2周时大量表达，4周时达高峰，8周时开始下降但仍较高。与假手术组相比，模型组各时间点GFAP表达明显增多(P＜0.01)。与模型组比较，治疗组各时间点GFAP表达明显(P＜0.01)。见表2和图2。

表2　各组不同时间点大鼠海马CA1区GFAPWestern blotting结果

图2　各组不同时间点大鼠海马CA1区GFAPWestern blotting结果

3　讨论

血管性痴呆的发病机制至今尚未完全明确，研究提示炎性反应及免疫活性因子参与血管性痴呆的发病过程[8]。胶质细胞是炎症反应的重要参与者，其中星形胶质细胞是脑内神经细胞炎症反应的主要效应细胞。在生理情况下，星形胶质细胞具有支持、营养神经细胞的作用，但在脑缺血的病理状态下，星形胶质细胞被激活后产生大量的一氧化氮、白细胞介素-6等细胞毒性因子，而引起神经元的损伤[9]。GFAP是星形胶质细胞的特征性标记物，其大量表达是星形胶质细胞活化的一个重要特征[10]。

有研究表明，在血管性痴呆模型大鼠脑组织中星形胶质细胞的胞体肥大肿胀，突起增粗延长，分支减少等现象，其标志性蛋白GFAP表达明显增强，并伴有学习记忆能力的减退[11]。本研究的结果表明，血管性痴呆模型组各时间点大鼠海马CA1区GFAP蛋白表达明显增多，1周时即有多量表达，2周时大量表达，4周时达高峰，8周时开始下降但仍较高。说明血管性痴呆模型大鼠海马CA1区有明显的星形胶质细胞增生和活化，星形胶质细胞呈激活状态。

近年来，中药在血管性痴呆治疗中的作用越来越得到重视[12-15]。养血清脑颗粒主要有由川芎、当归、白芍、钩藤、熟地黄、鸡血藤、决明子、夏枯草、细辛、延胡索、珍珠母组成，在改善脑皮层微循环、增加脑血管量、减轻脑损伤等方面具有显著效果[16-17]。养血清脑颗粒具有养血活血、平肝潜阳的作用，标本兼治，符合中医治疗血管性痴呆的要求。

作为现代中药复方制剂，养血清脑颗粒具有多靶点、多环节、整体性调节机体的特点。文献报道，养血清脑颗粒具有抑制神经细胞凋亡，保护神经元缺血性损害[18]。我们的系列研究已证实养血清脑颗粒能改善血管性痴呆大鼠学习记忆能力，这已在先前的研究中报道[19-20]。本研究的结果显示，治疗组大鼠海马CA1区GFAP表达明显降低，说明养血清脑颗粒可抑制血管性痴呆大鼠海马CA1区星形胶质细胞增生和活化，对血管性痴呆有治疗作用，且随着用药时间的延长，其作用更明显。由上述研究结果推测，血管性痴呆大鼠海马CA1区星形胶质细胞呈明显增生和活化状态，养血清脑颗粒能通过抑制星形胶质细胞的增生和活化，发挥对血管性痴呆的治疗作用。

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Effect of Yangxue Qingnao Granule on Expression of Glial Fibrillary Acidic Protein in CA1 Area of Hippocampus in Ratswith Vascular Dementia

DONG Jing1a,LIJin g1b,LIU Bin1b,MAOWen-jing1b,ZHANG Jin-xia1b,LIShi-ying1b
1.a.Physiatry Department;b.FirstDepartmentof Neurology,HospitalAffiliated to North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei063000,China

Objective To investigate the effectof Yangxue Qingnao granule on the expression of glial fibrillary acidic protein(GFAP)in CA1 area of hippocampus in ratswith vascular dementia(VD).Methods 144 Sprague-Daw ley ratswere random ly divided into sham operation group(n=48),VD group(model group,n=48)and Yangxue Qingnao granule treatmentgroup(treatmentgroup,n=48).The VD model was prepared bymodified Pulsineli's four-vesselocclusion.The sham operation group and themodelgroup were given normal saline 10m l/ (kg·d)by gavage,and the treatmentgroup wasgiven Yangxue Qingnao granule 3.2 g/(kg·d)by gavage.The expression of GFAP in CA1 area of hippocampuswas detected with immunohistochem ical analysis and Western blottingmethod 1,2,4 and 8 weeks aftermodeling.Results The expression ofGFAP in CA1 area of hippocampuswas significantly higher in themodelgroup than in the sham operation group(P＜ 0.01),and was lower in the treatment group than in themodel group(P＜0.05)at every time point.Conclusion Yanxue Qingnao granule could inhibit the activation and proliferation of astrocytes in rats.

vascular dementia;astrocytes;glial fibrillary acidic protein;Yangxue Qingnao granule;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.12.003

R749.1

A

1006-9771(2015)12-1375-04

1.河北省高等学校科学技术研究重点项目(No.ZH2012046)；2.河北省级重大医学科研课题(No.zd2013087)。

1.华北理工大学附属医院，a.康复科；b.神经内一科，河北唐山市063000。作者简介：董静(1980-)，女，汉族，河北唐山市人，硕士，主治医师，主要研究方向：脑血管病康复。通讯作者：刘斌，男，硕士，主任医师，教授，硕士研究生导师，主要研究方向：脑血管病及认知障碍。E-mail:liubintsh@126.com。

2015-09-14

2015-10-28)