曹 雪

Chengdu Sport University，Chengdu Sichuan 610041

郑怀贤的伤科内服经验方郑氏三七散，由四制香附、三七、当归、甘草为主要原料构成，主要用于治疗由急性闭合性软组织损伤引起的肢体局部肿胀、疼痛、功能障碍等，特别适用于急性肌肉、肌腱和韧带等损伤，其疗效显著，得到了广泛的验证。但由于种种原因，其毒理性方面的知识还不太明了。有许多学者对郑氏伤科配方［1-3］及按摩手法［4-8］进行了一些研究，其研究结论证明郑氏的伤科配方和治疗手法具有非常明显的疗效。但是目前对郑氏三七散的毒理方面的研究较少。据文献，在一些中药及其制剂中，其含有的毒素成分具有直接或者间接导致肾脏的肾小管的损伤和坏死［9］。这些研究都证实了一些中药成分对肾脏具有危害的作用，前人的的研究成果为本研究提供了一些理论依据［10］。本研究通过给大鼠服用不同剂量的郑氏三七散进行动物干预实验，并检验相关的病理学指标，以此来了解服用不同剂量的郑氏三七散对肾细胞是否造成危害，以期对郑怀贤教授的配方加以推广。

1 材料与方法

1.1 实验动物材料

健康雄性 Sprague-Dawley(SD)大鼠48只，3月龄，体重282.40±17.34g，由四川大学华西医学院动物实验中心提供，动物生产物许可证号:SCXK(111)-10-2006。动物饲养采用国家标准啮齿类动物饲料，饮用水为清洁自来水。动物房室温维持18-25℃，相对湿度30%-50%。

1.2 指标检测用仪器及试剂

测试仪器:半自动干式生化分析仪(sysmexk21n，美国);切片机(LEICA RM 2135，德国);全自动包埋机(LEICA EG 1150H，德国);病理组织漂片仪(Leica HB 1210，德国);病理组织烘片仪(Leica HI 1220，德国);OLYMPUS BX51显微镜(日本)以及OLYMPUSDP70照相系统。

测试试剂:中药材均购自成都同康药房有限责任公司。指标检测使用试剂:尿素氮(BUN)试剂盒(sysmex-k21n分析仪配套试剂);肌酐(Cr)测试盒(sysmex-k21n分析仪配套试剂)。二甲苯、甲醛、95%乙醇、HE染料石蜡等均为市购。

1.3 方法

1.3.1 试验药物制备

将郑氏三七散中的四制香附、三七、甘草按照《郑怀贤医著集粹》［11］的方法制成散剂。制备过程参照《中华人民共和国药典》［12］及《中药制剂学》［13］有关散剂的制备方法制备。郑氏三七散常规剂量组按照人与动物间药物服药剂量的换算:常规剂量每次用药量为郑氏三七散生药0.22g，将其水煎制成含生药量0.11g/mL，2mL/次。使用常规剂量的2倍、3倍用药量分别制成中等剂量组和大剂量组用药，即中等剂量组水煎剂含量为郑氏三七散生药量0.22g/mL，2mL/次。大剂量组水煎剂含生药0.44g/mL，2mL/次。制好的药剂保存在4℃的冰箱中备用，服用前水浴加热到37℃。

1.3.2 动物分组与给药

SD雄性大鼠48只，体重282.40±17.34g。实验室适应性喂养1周，观察大鼠有无异常情况。然后随机分为四组:空白对照组、常规剂量组，中等剂量组和大剂量组，每组12只。

造模分组1小时后开始给药，采用灌胃给药液方法，2次/天，共3周。对照组采用同样的方法灌服等量温开水。

1.3.3 取材及标本处理

各组实验大鼠于干预后3周末取材，分别称取SD大鼠体重，记录并作为实验后体重。根据经济合作和发展组织(OECD)相关内容进行仁慈处死动物。采用剪断血管取血，将血放置在对应的试管中备用;取血后进行颈椎脱臼处死法，取出大鼠左侧肾脏并去除包膜，称重后放置在对应的4%甲醛溶液中固定备用。

血液指标处理:末次灌胃1小时后，在右股动脉无菌条件下取血5mL测定。

肾组织处理:将肾脏包膜外的软组织去除，经过预处理后检验。

1.4 统计学分析

所有数据采用SPSS 19.0软件包进行处理，描述统计和参数分析用于该研究的数据分析，描述统计的所有变量的数据用“平均值±标准差”来表示，参数分析采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行比较分析，显著水平设置为α=0.05。

2 结果

2.1 实验对象基本情况

2.1.1 样本情况

实验过程中观察，服用不同剂量郑氏三七散和对照组大鼠一般情况良好，皮毛光泽，粪便性状颜色正常，食量未见异常。实验结束后，对大鼠的样本进行统计，除对照组1只死亡，中等剂量组1只不符合要求外，其余各组大鼠成活并符合取材条件。

2.1.2 大鼠体重生长变化情况

SD大鼠进入实验室即进行编号记录，每天记录大鼠体重等指标。其0、1、2、3周各组体重见表1所示，在上述时间点各组的体重经单因素ANVOA分析，在0、1、2、3 周体重没有显著性差别(F=2.62，P=0.15＞0.05;F=1.78，P=0.19＞0.05;F=2.35，P=0.17＞0.05;F=1.12，P=0.35＞0.05)。实验中各组大鼠的体重增随着时间增加而增加。

表1 实验大鼠不同时相体重比较(单位:g)

2.2 各组大鼠镜检结果

服用不同剂量郑氏三七散各组大鼠与空白对照组之间的肾组织细胞光镜下显示(见图1所示)有如下特点:各组大鼠的肾脏的肾单位结构状况完整，没有出现水肿和萎缩等异常症状，各组大鼠肾脏的肾细胞没有出现变性及坏死情况;各组大鼠的肾脏的肾间质之间正常，没有观察到各类细胞浸润及结缔组织增生的现象出现。

2.3 各组大鼠肾脏重量和肾脏系数

不同剂量郑氏三七散及对照组的肾脏重量及肾脏系数值见表2所示，对肾脏重量及肾脏系数值分别进行单因素ANOVA检验，结果显示肾脏重量(F=0.97，P=0.241＞0.05)和肾脏系数(F=1.47，P=0.138＞0.05)在不同剂量组以及对照组组之间没有显著性差异。

表2 不同剂量郑氏三七散对肾脏重量及肾脏系数的影响

2.4 血液生化指标结果

不同剂量郑氏三七散对血液中尿素氮及肌酐的含量见表3所示，对尿素氮和肌酐检测分别进行单因素ANOVA检验，结果显示尿素氮(F=2.16，P=0.138＞0.05)和肌酐(F=3.49，P=0.215＞0.05)不同剂量组以及对照组组之间没有显著性差异。

图1 不同剂量组大鼠肾组织细胞切片观察(×40)

表3 不同剂量郑氏三七散对血液中尿素氮及肌酐的影响

3 分析与讨论

大鼠等实验动物的某些脏器，一般选用肾脏、心脏、肺、脑或者陴等器官，用某一器官的重量以及该器官的重量与其体重的比值及作为重要的评价指标，该指标在毒理学安全性体系评价中经常用作衡量受试动物是否受到异常的环境的影响而产生变化。本研究选取实验大鼠的肾脏重量和肾脏系数来作为检测值其目的是为了更直观方便地了解实验大鼠肾脏本身的变化情况。从服用不同剂量的大鼠与空白对照组的大鼠之间的肾脏重量与肾脏系数来看，服用不同剂量郑氏三七散各组大鼠的该值与对照组相比没有多大差别。肾脏系数处于正常值范围之内，可以断定服用不同剂量的郑氏三七散对大鼠肾脏系数没有多大的改变，因此认为该配方在这一指标上不会使大鼠的肾脏产生毒理学的改变。

作为体内多种药物代谢的器官肾脏，在对动物进行试验时，有许多研究报道［14-16］药物的毒性反应使得肾脏受到损害。检测肾脏受到伤害，一般把肾组织切片，然后经过HE染色后，对其进行观察。本实验从病理切片的定性角度分析实验大鼠的肾细胞的损害情况。其结果显示服用不同剂量的各组大鼠与空白对照组的实验大鼠一样，其肾脏的肾单位结构呈现完整状况，服用不同剂量郑氏三七散与空白对照组大鼠的肾单位皆未出现水肿、萎缩等异常情况，各组大鼠的肾细胞也没有出现变性及坏死状况，各类细胞浸润及结缔组织增生的症状也没有出现在服用不用剂量郑氏三七散和对照组的大鼠肾脏上。综上所述，大鼠在实验期间服用不同剂量的郑氏三七散对肾组织细胞无破坏作用，由此证明郑氏三七散的毒性对大鼠肾脏没有明显的影响。

肌酐(Cr)是肌肉在活动过程中代谢的产物，在临床上，该指标用于作为了解肾功能好坏的主要指标之一。血清中肌酐浓度变化主要受到肾小球的滤过能力的影响，该能力下降，则会引起肌酐的浓度上升，该指标如果高出正常值的范围，则意味着肾脏受到了伤害。血液中肌酐高会导致一系列的不良现象:会导致钠、钾代谢失调，具体的表现是高肌酐常常会伴随着高或者低钠或钾血症状，会产生水代谢失调，其具体表现在尿量增多，口渴，血压升高等，还会使得循环系统、消化系统等发生病变。在本实验中，服用不同剂量的郑氏三七散的大鼠，其血液中肌酐的值随着剂量的增加略有上升，不过都低于对照组，在统计上没有显著性的意义，其原因可能是郑氏三七散中含有可使肌酐降低的药物，由该指标可知，不同剂量的郑氏三七散对用于评价肾脏指标的肌酐来说，具有有利于肾脏保护的作用。血尿素氮(BUN)是蛋白质代谢的主要终末产物。该指标在临床上和肌酐一起用于对肾脏功能的评价。该指标增加，可以作为诊断慢性肾衰竭的指标，临床上患者出现的症状有严重脱水，出现大量腹水，伴随着心脏循环功能的紊乱。在临床上出现的各种肾功能方面的实质性病变，例如急慢性肾功能衰竭、间质性肾炎、肾小球肾炎、肾内占位性或者破坏性肾脏功能病变均可导致血液中的尿素氮含量浓度增高。在本实验中，服用不同剂量的郑氏三七散大鼠的血尿素氮的含量大致相同，在8.5mmol/L左右，且均低于空白对照组的9.5mmol/L。但均在正常范围内，可以认为服用不同剂量郑氏三七散对大鼠的肾功能影响无副作用，其药理毒性甚低。

4 结论

(1)服用不同剂量郑氏三七散与对照组大鼠的外观形态和行为活动表现正常，无异常现象出现，且各组大鼠的体重增加相似，可认为服用不同剂量的郑氏三七散对大鼠的生长没有不良反应。

(2)服用不同剂量的郑氏三七散与对照组相比较，血肌酐和尿素氮等血液指标无明显差别，本研究认为郑氏三七散的肾毒性甚低。

(3)服用不同剂量的郑氏三七散的大鼠，其肾单位结构完整，未见水肿、萎缩等异常，肾细胞未见变性及坏死，各种现象表明郑氏三七散对肾组织细胞无破坏作用，该药使用安全，无副作用，适合临床使用。

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