周涛，陈长宝*，周杰，游桂荣

1.山东农业大学化学与材料科学学院，山东泰安271018

2.泰山医学院药学院，山东泰安271016

3，3＇-二氯联苯胺分子印迹整体柱的识别性能研究

周涛1，陈长宝1*，周杰1，游桂荣2

1.山东农业大学化学与材料科学学院，山东泰安271018

2.泰山医学院药学院，山东泰安271016

以3，3＇-二氯联苯胺为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，偶氮二异丁腈为引发剂，乙二醇二甲基丙烯酸酯作为交联剂，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体为致孔剂，乙腈和氯仿混合溶液为溶剂，合成了3，3＇-二氯联苯胺分子印迹整体柱。考察了3，3＇-二氯联苯胺分子印迹整体聚合物的结合性质及其在3，3＇-二氯联苯胺分子聚合物上的选择性分离富集特性。得到的分子印迹聚合物整体柱，对模板分子具有特异的识别能力，在所选择的色谱条件下，3，3＇-二氯联苯胺与类似物可以得到较好的分离。

分子印迹；3，3＇-二氯联苯胺；高效液相色谱；整体柱

分子印迹技术（Molecular Imprinting Technology，MIT）［1，2］是指制备对某一特定的目标分子（模板分子、印迹分子或烙印分子）具有特异选择性的聚合物的过程。它可以被形象地描绘为制造识别分子钥匙［3］的人工锁技术，由于这种印迹聚合物对印迹分子具有专一识别性，而且具有稳定性好、使用寿命长等优点，因而倍受人们的关注。

多氯联苯（Polychlorinated biphenyls，PCBs）［4-6］是一类人工合成的广泛存在于生物圈的持久性有机污染物（Persistent organic pollutants，POPs），其分子结构为联苯苯环上的氢原子被氯原子取代而形成。3，3＇-二氯联苯胺（3，3＇-dichlorobenzidine，DCB）是生产联苯胺黄和永固橘黄等不可替代的原料。DCB是动物致癌物质，可诱导大鼠、小鼠、仓鼠及狗等多种动物发生肿瘤［7］，对人为可疑致癌物。对环境有危害，对水体可造成污染。DCB作为永久性有机污染物，易挥发性使得其污染途径及危害成为关注的焦点。因此，明确DCB的环境行为，准确检测环境中DCB的残留，对消除其危害极为重要。

目前，常用的DCB检测方法有紫外分光光度法［8］、高效液相色谱法［9］。但这些方法前处理过程复杂，且成本较高。分子印迹聚合物（MIP）整体柱制备方法简单，选择性好且成本低，在色谱分离、固相萃取等方面得到了广泛的应用［10］。用原位聚合法制备分子印迹整体柱已有许多报道，但这些报道多数使用有机溶剂作为致孔剂，对强极性有机化合物的识别受到一定限制［11］。

室温离子液体一般是由含氮、磷的有机阳离子和无机阴离子组成的在室温时呈液态的液体。通过改变阴阳离子组成，可以合成不同性质的离子液体，因此离子液体又是一种新型的可设计的绿色溶剂。离子液体具有特殊物理化学性质，与传统的挥发性有机溶剂相比具有一系列突出的优点：（1）超低蒸汽压、不挥发、不易燃、无色、无臭、毒性小不易爆炸；（2）较大的稳定温度范围、较好的化学稳定性；（3）较宽的电化学稳定电位窗；（4）可溶解无机、有机、有机金属、合成或天然高分子材料等物质；（5）绝大多数离子液体常压下密度比水大；（6）粘度比一般有机溶剂或水的粘度高1～2个数量级，但仍具有良好的流动性；（7）表面张力比一般有机溶剂高、比水低，使用时可以加速相分离的过程。本研究选用离子液体为致孔剂可克服上述的缺点，制备了DCB的分子印迹整体柱对模板分子DCB表现为较高的选择性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Nicolet-380型傅立叶变换红外分光光度计（美国Thermo公司，KBr压片）；UV-2450型紫外-可见分光光度计（日本岛津）；H-800型电子显微镜（日本日立公司）；DZF-3型真空干燥箱（上海福玛实验设备有限公司）1810-B型石英自动双重纯水蒸馏器（江苏金坛中大仪器厂）；AUY120型分析天平（日本岛津）；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；KQ-50B型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TB-85型超级恒温水浴（日本岛津）；SHZ-82气浴恒温振动器（金坊市精达仪器制造厂）；LC-20AT高效液相色谱（日本岛津）；色谱柱：150 mm×4.6 mm I.D.

3，3＇-二氯联苯胺盐酸盐（DCB，98%），氯仿（分析纯），甲基丙烯酸（MAA，分析纯），购自阿拉丁试剂有限公司；无水乙醇（分析纯），乙腈（色谱纯），甲醇（色谱纯），冰乙酸（分析纯）购自天津永大化学试剂有限公司；氢氧化钠（分析纯），购自天津大陆化学试剂厂；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸（分析纯），购自河南利华制药有限公司；浓盐酸（36%）购自烟台双双化工有限公司；二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA，98%）购自百威灵化学技术有限公司；偶氮二异丁腈（AIBN，化学纯）购自南开大学特种化学试剂试验厂，用甲醇重结晶后使用；实验中EGDMA，MAA均蒸馏除去阻聚剂后使用；实验用水均为重蒸水。

1.2 模板分子DCB的制备

由DCB盐酸盐制备模板分子DCB：将11.260 g（0.044 moL）DCB盐酸盐加入100 mL三口瓶内，再加入10%的盐酸15 mL及50%的乙醇水溶液15 mL边搅拌边升温，待其全部溶解后冷却至20ºC，在搅拌下逐渐滴加30%的氢氧化钠溶液至pH=8～10，这时有大量结晶析出。冷却后抽滤、干燥，再进行重结晶得浅黄色针状分子化合物DCB。

1.3 DCB分子印迹聚合物

1.3.1 本体聚合法制备DCB分子印迹聚合物将0.5063 g（2 mmoL）模板分子DCB，0.680 mL（8 mmoL）功能单体MAA和2.5 mL乙腈、12.5 mL氯仿加入到30 mL的磨口锥形瓶中，通氮气20 min，密封，于0ºC冰水浴中避光静置6 h，使模板分子与功能单体充分作用后，加入7.540 mL（40 mmoL）EGDMA，离子液体BMIM+PF6-2.6 mL，30 mg AIBN，超声溶解至溶液澄清透明，将上述溶液装入安瓿瓶中，通氮气20 min，密封，与60ºC水浴中反应12 h，得到棒状固体。将固体在研钵中磨碎，过筛，收集200～400目的聚合物颗粒，放入索提取器中，用乙腈/乙酸（体积比为9：1）连续抽提，除去模板分子后，再用乙腈洗至中性，抽滤后置55ºC真空干燥箱中干燥至恒重，得到不规则粒状的MIP。

相对应的非印迹聚合物NIP的制备：除不加模板分子外，其余步骤同上。

1.3.2 印迹聚合物的吸附动力学研究准确称取模板聚合物50 mg于磨口锥形瓶中，加入5.0 mL二氯联苯胺乙腈溶液，放入振荡器中于29ºC振荡，每隔1 h取吸附液样品于离心试管中，离心后取一定量的离心液，稀释后用紫外分光光度计于287 nm进行光度分析，测定二氯联苯胺在乙腈中的平衡浓度，根据吸附前后二氯联苯胺浓度的变化，可计算吸附量。吸附底物后的模板聚合物按照除去模板分子的方法洗去底物，干燥后可重复使用（平行3次）。

1.3.3 聚合物的吸附等温线准确称取模板或非模板聚合物50 mg于磨口锥形瓶中，加入5.0 mL二氯联苯胺乙腈溶液，放入振荡器中于25ºC振荡24 h，然后取吸附液样品于离心试管中，离心后取一定量的离心液，稀释后用紫外分光光度计于287 nm进行光度分析，测定二氯联苯胺在乙腈中的平衡浓度，根据吸附前后二氯联苯胺浓度的变化，可计算吸附量。吸附底物后的模板聚合物按照除去模板分子的方法洗去底物，干燥后可重复使用（平行3次）。

1.4 DCB分子印迹整体柱的制备

采用原位聚合法制备DCB分子印迹整体柱。其制备方法如下：将0.1519 g（0.6 mmoL）模板分子DCB 0.204 mL（2.4 mmoL）功能单体MAA和0.75 mL乙腈、3.75 mL氯仿加入到30 mL的磨口锥形瓶中，通氮气20 min，密封，于0ºC冰水浴中避光静止6 h，使模板分子与功能单体充分作用后，加入2.262 mL（12 mmoL）EGDMA，离子液体BMIM+PF6-0.78 mL，10 mg AIBN，超声溶解至溶液澄清透明超声脱气20 min，，将上述溶液立即转至色谱柱中（150 mm×4.6 mm），并将两端密封，在60ºC的温度下反应12 h，更换柱头后将其接到HPLC泵上，用乙腈/乙酸（体积比9：1）溶液充分冲洗直至基线水平，得到DCB分子印迹整体柱。

相对应的非印迹整体柱的制备：除不加模板分子外，其余步骤同上。

1.4.1 整体柱的表面结构观察将合成好的整体柱压出柱管；用扫描电子显微镜（SEM）对其进行微观结构扫描。

1.4.2 色谱实验准确称取一定量的联苯胺、邻苯二胺、对氯苯胺、二苯胺、4-乙酰氨基酚和DCB用甲醇溶解，配制成50 μg/mL的一系列标准溶液备用。以体积比7：3甲醇/水混合液为流动相评估印迹整体柱的识别性能。流动相流速为0.5 mL/min，进样量为20 μL，检测波长为287 nm，所有的色谱实验均在室温下进行。

2 结果与讨论

2.1 整体柱的表面结构观察

图1 非印迹和印迹整体柱横截面的扫描电子显微镜图Fig.1 The scanning electron microscope（SEM）images of DCB imprinted monolithic colum（B），（C）and non-imprinted monolithic column（A）

用扫描电镜（SEM）对用离子液体做致孔剂合成的非印迹整体柱、印迹整体柱及未加离子液体制备合成的印迹整体柱的表面形态和结构进行了表征（见图1）。从图1可以看出，用离子液体制备的印迹整体柱B及非印迹整体柱A的粒径均在0.1～0.3 μm范围内，孔隙分布均匀，而不加离子液体制备的印迹整体柱C颗粒跟孔径明显小于同条件下离子液体作致孔剂制备的整体柱A与B由此可以看出离子液体作致孔剂制备的整体柱孔道多增大聚合物的比表面积，相较于不加离子液体作致孔剂的整体柱有良好的通透性；印迹整体柱B相对于非印迹整体柱A粒状明显，孔道多，包裹在网络骨架中具有良好分布的微孔通道，保证了印迹柱的高渗透性和快的传质速率，原因可能是在制备过程中，模板分子在聚合物母体中占有一定的空间和体积，被洗脱后，这种空间和体积被固定下来，从而增大了聚合物的比表面积，为印迹聚合物对模板分子的选择性识别提供了良好的通透性。因此可以推断印迹整体柱对模板分子DCB有一定的选择性吸附作用。

目前已有将离子液体作为分子印迹聚合物合成的溶剂和致孔剂的报道，也有研究表明离子液体的存在可加速聚合过程，提高特异识别能力和结合量［13-16］。

2.2 印迹聚合物的吸附动力学研究

图2为DCB印迹聚合物的吸附动力学曲线。由图2可见，聚合物在前4 h内对DCB吸附量迅速增大，由此后缓慢增加，5 h饱和吸附量趋于稳定，说明聚合物孔穴能吸附模板分子达到平衡。

2.3 聚合物的等温吸附曲线分析

图2 DCB印迹聚合物吸附动力学曲线Fig.2 Adsorption kinetics curveofDCBonthe molecularly imprinted polymer

图3 DCB在印迹聚合物和非印迹聚合物上的吸附等温线Fig.3Adsorption isotherms of DCB on the MIPand NIP

由图3可见，在25ºC在一定浓度范围内，印迹与非印迹聚合物对DCB的吸附量均随DCB浓度的增大而增大，但是印迹聚合物的吸附量均明显的大于非印迹聚合物，且二者的吸附量之差随溶液浓度的增加而增大。说明组成相同的两种聚合物的空间结构存在明显的差异。其原因是MIP包含有固定排列的功能基的空间空穴，其大小和固定排列的功能基与模板分子DCB互补，这种空穴对DCB分子呈现“记忆功能”。两种聚合物的吸附量的差值主要来源于这种空穴的选择性吸附。这是MIP突出的结构特征。超过一定浓度范围印迹聚合的吸附量不随浓度的增加而增加，说明印迹聚合物的吸附量已达到饱和。

2.4 印迹聚合物的Scatchard分析

分子印迹聚合物研究工作中常用Scatchard模型来评价聚合物结合特性［26］，本文将印迹聚合物结合等温吸附曲线获得的结果进行Scatchard分析，来考察所制得的DCB-MIP对DCB的结合机理。

Scatchard方程如公式（1）：

其中，Q为DCB在DCB-MIP上的平衡结合容量（mmoL/g），Ce为模板分子在吸附液中的平衡浓度（mmoL/L），Qmax为结合位点的表观最大结合常数（mmoL/g），Kd为结合位点的平衡解离常数（mmoL/L）。图4是MIP在乙腈溶液中对DCB吸附特征的Scatchard曲线。由图4可以看出，Q/Ce-Q曲线明显呈线性关系，这表明印迹聚合物存在一类等价的结合位点，对DCB呈现均匀的亲和力，这种结果来自于分子印迹过程中的模板效应。在所研究的模板浓度范围内印迹聚合物对DCB的非选择性吸附作用达到可以忽略的程度。拟合后得到其线性回归方程：Q/Ce=0.02638-2.32946Q（R2=0.9730），由直线斜率和截距可以求得结合位点的平衡解离常数Kd=0.4293 mmoL/L，最大表观结合量Qmax=0.01132 mmoL/g。

图4 评价MIP结合性质的Scatchard曲线Fig.4ScatchardplotstoestimatethebindingnatureofMIP

图5 DCB及其类似物分子结构式Fig.5ThemolecularstructuralformulasofDCBandanalogues

2.5 分子印迹整体柱印迹效应和识别性能评价

为了探讨MIP整体柱的识别性能，以模板DCB和其结构类似物联苯胺、邻苯二胺、对氯苯胺、二苯胺、4-乙酰氨基酚为分析物（分子结构如图5），用体积组成为7：3的甲醇/水混合液作流动相，在流速为0.5 mL/min和287 nm的检测波长的条件下测定了分析物在印迹柱与非印迹柱上的保留时间，以此计算保留因子（retention factors，k＇）、分离因子（separation factors，α）和印迹因子（imprinting factors，IF）。丙酮作为不保留物质用以测定体系的死时间，所有实验均在室温下进行。

按文献［12］报道，分离因子（α）和印迹因子（IF）的定义分别为：

表1 DCB印迹和非印迹整体柱上选择性系数的比较Table 1 Imprinted and nonimprinted monolithic column on the comparison of the selective coefficient

模板分子DCB在印迹柱上的保留因子k＇MIP为6.072，而在非印迹柱上的保留因子k＇NIP为1.845，根据印迹因子IF=k＇MIP/k＇NIP的定义［12］，印迹整体柱的印迹因子IF为3.291。从表1中可以看出在印迹柱上类似物相对于模板分子DCB的保留因子均明显大于非印迹柱上的保留因子，这进一步表明所获得的DCB分子印迹整体柱对模板分子DCB具有优异的识别能力和记忆效应。

3 结论

本实验采用原位聚合法制备了3，3-二氯联苯胺分子印迹聚合物整体柱，通过Scatchard分析证明其结合位点主要为一类等价结合点并求得该结合位点的平衡解离常数Kd为0.4293 mmoL/L，最大表观结合量Qmax为0.01132 mmoL/g。色谱实验证明该分子印迹整体柱对3，3-二氯联苯胺呈现出较强的选择性吸附能力和模板记忆效应，以该柱为基础有望实现建立DCB高选择性色谱测定方法。

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Studyon Recognition Characteristicsof 3，3＇-dichlorobenzidine Imprinted Monolithic Column

ZHOU Tao1，CHEN Chang-bao1*，ZHOU Jie1，YOU Gui-rong2
1.College of Chemistry and Material Science，Shandong Agricultural University，Taian，271018，China
2.School of Pharmaceutics，Taishan Medical University，Taian 271016，China

Using3，3'-dichlorobenzidine asthe template，methacrylicacid（MAA）asthe functionalmonomer， azobisisobutyronitrile（AIBN）as a initiator，ethylene glycol dimethacrylate（EGDMA）as the cross-linker，BMIMPF6as the porogent，and the mixture of acetonitrile and chloroform as the solvent，a 3，3'-dichlorobenzidine imprinted monolithic column was prepared by in situ molecular imprinting technique，and its binding properties and selectivity were investigated. The3，3'-dichlorobenzidine molecularlyimprintedmonolithic polymerhasspecificrecognitionability for3，3'-dichlorobenzidine.3，3＇-dichlorobenzidine and its structural analogues were separated under selected conditions.

Molecular imprinting；3，3＇-dichlorobenzidine；high performance liquid chromatography（HPLC）；monolithic column

O657.7+2

A

1000-2324（2015）01-0033-05

2012-11-12

2013-01-22

国家自然基金（21175083）

周涛（1987-），女，硕士研究生，主要从事生物化学研究.E-mail：zhoutaonini1987@163.com

*通讯作者:Author for correspondence.E-mail：chchbao@sdau.edu.cn