张 君，崔文璟，刘 义，崔幼恬，周哲敏

（江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122）

恶臭假单胞菌腈水合酶βAla97影响催化己二腈的区域选择性

张 君，崔文璟，刘 义，崔幼恬，周哲敏

（江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122）

对恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）腈水合酶（PpNHase）催化己二腈进行研究，发现PpNHase只能催化己二腈中1个氰基生成单酰胺产物5-氰基戊酰胺，具有区域选择性；睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）腈水合酶（CtNHase）能催化己二腈直接生成己二酰二胺，不具有催化区域选择性。为了阐明这一区域选择性差异的机制，对CtNHase和PpNHase β亚基的氨基酸序列进行比对，结果显示同源性为94.1%，CtNHase存在βAla97缺失。基于此分析，构建了PpNHase β97位Ala的缺失突变体（ΔAla97）。利用高效液相色谱检测ΔAla97催化己二腈的产物，发现ΔAla97能将底物完全催化为己二酰二胺，表明βAla97是影响催化己二腈由5-氰基戊酰胺向己二酰二胺转化的关键氨基酸。

腈水合酶；己二腈；生物催化；区域选择性

腈水合酶（EC 4.2.1.84，nitrile hydratase，NHase），是一种用来催化腈类物质生成酰胺类物质的金属酶［1］，在自然界中分布广泛，大多产腈水合酶的微生物为革兰氏阳性菌属，如诺卡氏菌属（Nocardia）、红球菌属（Rhodococcus）、假棒状杆菌属（Corynebacterium）、假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）、短杆菌属（Brevibacterium）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、假单胞菌属（Pseudomonas）和丛毛单胞菌属（Comamonas）等。腈水合酶根据活性中心所需辅因子的不同，一般可以分为钴型腈水合酶［2］（Co-NHase）和铁型腈水合酶［3］（Fe-NHase）。恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）来源的NHase为钴型腈水合酶，成熟酶由2个α亚基和2个β亚基构成［4］，一般以α2β2四聚体形式存在，α亚基和β亚基的相对分子质量分别为2.3×104和2.41×104［5］，其活性中心Co2+的摄取依赖编码β、α亚基基因（ba）下游p基因的翻译产物P亚基，通过自身交换机制来完成［2］。……