袁承军，袁浩宇，俞瑜，王鹏

（1.四川省绵阳市中心医院，四川绵阳621000；2.核工业四一六医院药剂科，四川成都610051）

高效液相色谱法测定益母草碱大鼠血浆浓度及其药代动力学研究

袁承军1，袁浩宇2，俞瑜2，王鹏2

（1.四川省绵阳市中心医院，四川绵阳621000；2.核工业四一六医院药剂科，四川成都610051）

目的建立测定大鼠血浆中益母草碱质量浓度的高效液相色谱（HPLC）法，并研究益母草碱在大鼠体内的药代动力学特征。方法8只SD大鼠尾静脉注射益母草碱后，采用HPLC法测定血浆中益母草碱的质量浓度，流动相为乙腈-0.02 moL/L磷酸二氢钾（磷酸调pH=4.0）=60∶40，波长为277 nm，流速为1 mL/min，柱温为30℃。结果益母草碱在大鼠体内分布符合二室模型，主要药代动力学参数消除半衰期（t1/2α）为（0.46±0.13）h，t1/2β为（2.90±1.41）h，中心室分布容积（V）为（0.46±0.07）L/kg，药时曲线下面积（AUC0-t）为（70.65±12.39）mg/（h·L）。结论该方法简便、快速，可用于体内益母草碱的测定及药代动力学研究。

益母草碱；高效液相色谱法；药代动力学

益母草碱有多种生物活性，如改善心肌缺血、增加冠脉血流量、抗凝、抗血栓形成、保护中枢神经系统、调节血脂、缩宫止血、活血化瘀、抗糖尿病等作用［1-5］。笔者采用高效液相色谱-紫外检测器（HPLC-UV）法测定大鼠血浆中益母草碱的含量，并对益母草碱的药代动力学特征进行了研究，现报道如下。

1 仪器、试药与动物

日本岛津LC-2010C型高效液相色谱仪；岛津LC-Solution型色谱工作站；德国赛多利斯BS224S型万分之一电子天平；Avati30型高速离心机（Beckman公司）；XW-80型旋涡混合器（上海医科大学实验仪器厂）。盐酸益母草碱（武汉东康源科技有限公司，批号为20120501）；盐酸益母草碱对照品（成都贝斯特试剂有限公司）；乙腈为色谱纯（美国Fisher公司）；水为重蒸水；其余试剂均为分析纯。SD大鼠8只，体重180～200 g，雌雄各半，购自上海西普尔-必凯实验动物有限责任公司，合格证号为SCXK（沪）2008-0016；试验前圈养3 d。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil BDS C18柱（200 mm×4.6 mm，3 μm）；检测波长：277 nm；流动相：乙腈-0.02 moL/L磷酸二氢钾（磷酸调pH=4.0）=（60∶40，V/V）；流速：1 mL/min；柱温：30℃。

2.2 血样处理

取血浆样品0.1 mL，加入6%高氯酸溶液0.2 mL，旋涡沉淀蛋白1 min，10 000 r/min的速率离心5 min，取上清液进样50 μL，记录色谱图和峰面积，以外标法按标准曲线计算血浆中益母草碱的质量浓度。

2.3 方法学考察

专属性试验：大鼠空白血浆、大鼠空白血浆+益母草碱对照品、大鼠尾静脉注射益母草碱后的血浆样品色谱图见图1。益母草碱的保留时间约为7.5 min，血浆内源性物质及其他杂质与主峰的分离度符合要求，不干扰样品的分离测定。

线性关系考察：取不同质量浓度的益母草碱对照品溶液20μL，加入0.1 mL空白大鼠血浆中，使血浆中含益母草碱系列质量浓度分别为0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，20.0，40.0 μg/mL，照2.2项下方法操作，记录色谱图。以益母草碱的质量浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，用最小二乘法进行线性回归，得标准曲线方程A=3 526.1 C-1 093.3，r=0.999 4（n=7）。结果表明，益母草碱质量浓度在0.5～40.0 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好，最低定量限为0.5 μg/mL。

图1 益母草碱的高效液相色谱图

精密度试验：取0.1 mL空白大鼠血浆，配制高、中、低3种不同质量浓度的质控样品各5份，照2.2项下方法分别在同1日内测定和连续测定3 d。结果质量浓度分别为1.0，5.0，20.0 μg/mL时，日内精密度RSD分别为4.97%，6.13%，5.52%（n=5），日间精密度RSD分别为7.85%，3.71%，4.69%（n=5），表明日内和日间精密度均良好。

提取回收率试验：取空白血浆0.1 mL，分别配制成高、中、低质量浓度（1.0，5.0，20.0 μg/mL）的益母草碱血浆样品（Cr）各1份，按2.2项下方法记录峰面积，并求出各质量浓度下3次进样峰面积的平均值（Ar）。另取高、中、低已知质量浓度（Cs）的益母草碱对照品溶液，不经处理直接进样，得峰面积As。以前后2种处理测定得到的主峰峰面积之比（Ar/As）计算提取回收率，结果平均提取回收率为90.43%，RSD为6.71%（n=3）。

方法回收率试验：取0.1 mL空白大鼠血浆，配制高、中、低3种不同质量浓度的质控样品各5份，照2.2项下方法测定，带入随行标准曲线进行计算，考察相对回收率。结果平均回收率分别为93.63%，90.10%，101.24%。

稳定性试验：取空白血浆0.1 mL，配制质量浓度为5.0 μg/mL的质控血浆样品数份，分别于自动进样器（5℃）中放置24 h，反复冻融3次，-80℃冰箱冷冻放置20 d，进行稳定性考察。高、中、低3个质量浓度于自动进样器中放置0，2，4，8，12，16，24 h时测定含量的RSD为7.92%，反复冻融3次，测得的RSD为3.15%，-80℃冰箱冷冻放置0，5，15，20 d时测得的RSD为4.73%，表明益母草碱血浆样品在上述条件下稳定性良好。

2.4 动物试验

取SD大鼠8只，雌雄各半，体重180～200 g，服药前禁食12 h，全程不禁水。次日晨尾静脉注射益母草碱水溶液（5 g/L，加热至37℃），给药量为20 mg/kg。给药4 h后统一进食。并于给药前及给药0.08，0.17，0.66，1.00，2.00，3.00，4.00，6.00，8.00，10.00 h时尾静脉采血0.3 mL，以4 000 r/min的速率离心10 min，分离血浆，-80℃冻存待测。

2.5 药代动力学参数

大鼠静脉注射益母草碱后益母草碱的平均血药浓度-时间曲线见图2。采用DAS 2.0药动学程序对血药浓度和时间数据进行拟合，益母草碱在大鼠体内变化过程符合二室模型，结果见表1。

图2 大鼠静脉注射益母草碱后平均血药浓度-时间曲线（n=8）

表1 大鼠单剂量注射20 mg/kg益母草碱后的药代动力学参数（n=8）

3 讨论

益母草有效成分主要为益母草碱、水苏碱、益母草定、益母草宁，目前已能通过合成获得［6］，张金莲等［7］研究了口服给药后益母草碱及其代谢物在大鼠体内的药代动力学和毒代动力学特征，发现益母草碱在大鼠体内的达峰时间为0.5～1.7 h，消除半衰期（t1/2）为2.1 h，具有吸收快和代谢快的特点，消除为线性动力学，体内主要以益母草碱葡萄糖醛酸结合物的形式存在。

本研究结果显示，益母草碱在大鼠体内分布符合二室模型，静脉注射给药后，在大鼠体内的分布消除速度较快。

本研究中建立的测定血浆中益母草碱的HPLC法，样品处理简单，血浆中内源性物质及其他杂质对测定无干扰，方法回收率为90.10%～101.24%，日内、日间精密度RSD均小于10.00%，可用于益母草碱的药代动力学和生物利用度研究。

［1］贺春晖，赵懿清，李霞，等.益母草碱药理作用的分子机制研究进展［J］.中国临床药理学与治疗学，2013，18（12）：1 419-1 423.

［2］钱海兵，徐玉平，罗魁.益母草碱对实验性高脂血症大鼠的降脂作用［J］.华西药学杂志，2012，27（5）：528-530.

［3］李霞，陈飞虎，袁凤来，等.益母草碱对药物流产后大鼠子宫的作用研究［J］.中国临床药理学与治疗学，2009，14（5）：481-486.

［4］Liu XH，Xin H，Hou AJ，et al.Protective effects of leonurine in neonatal rat hypoxic cardiomyocytes and rat infracted heart［J］.Clin Exp Pharmacol P，2009，36（7）：696-703.

［5］Loh KP，Qi J，Tan BK，et al.Leonurine protects middle cerebral artery occluded rats through antioxidant effect and regulation of mitochondrial function［J］.Stroke，2010，41（11）：2 661-2 668.

［6］Luo SS，Gu XF，Zhu YZ.Improved synthesis of leonurine as cardioprotective agent［J］.J Pharm Sci，2012，21（4）：292-295.

［7］张金莲，刘洪瑞，毛煜，等.益母草碱及其代谢物在大鼠体内的毒代动力学研究［J］.中国医药工业杂志，2012，43（6）：451-454.

Determination of Concentration of Leonurine in Rat Plasma by HPLC and Its Pharmacokinetics

Yuan Chengjun1，Yuan Haoyu2，Yu Yu2，Wang Peng2
（1.Mianyang Municipal Central Hospital，Mianyang，Sichuan，China621000；2.Department of Pharmacy，416 Hospital of Nucleus Industry Ministry，Chengdu，Sichuan，China610051）

ObjectiveTo establish the HPLC method to detect the mass concentration of leonurine in rat plasma，and the pharmacokinetics was evaluated.MethodsThe mass concentration of leonurine in 8 rats was detected after intravenous injection of 20 mg/kg leonurine by HPLC.The mobile phase was acetonitrile-0.02 moL/L mono potassium phosphate（adjusting to pH=4.0 with phosphoric acid）=60∶40，at the flow rate of 1.0 mL/min and detected at 277 nm，the column temperature was 30℃.ResultsThe process of leonurine in rats fit two-compartment model.The main pharmacokinetic parameters were followed：t1/2αwas（0.46±0.13）h，t1/2βwas（2.90±1.41）h，V was（0.46±0.07）L/kg，AUC（0-t）was（70.65±12.39）mg/（h·L）.ConclusionThis method was accurate，stable and sensitive，which can be used for the determination and pharmacokinetic of Leonurine.

leonurine；HPLC；pharmacokinetics

R285.5；R284.1

A

1006-4931（2015）20-0034-02

袁承军，男，副主任药师，研究方向为医院药学，（电子信箱）yuanchengjun0753@163.com；袁浩宇，男，副主任药师，研究方向为医院药学，本文通讯作者，（电子信箱）yhy416@ 126.com。

2014-11-13；

2015-02-12）