马可　陈雄　郑俊炯　陈嘉诚　丰岩清

多发性硬化动物模型神经功能评分的比较与改良

马可*陈雄*郑俊炯*陈嘉诚*丰岩清*

目的探讨三种神经功能评分方法在实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）模型中的应用情况，并提出最适评价标准。方法 32只雌性C57BL/6小鼠（18～20 g）随机分配为正常对照组（15只）、造模组（17只）。造模组用MOG33-35多肽与弗式完全佐剂等体积混合成乳剂后多点皮下注射制备成EAE模型。遵循双人双盲原则分别使用Kono’s 5分法、Weaver’s 15分法及改良15分法进行神经功能评分，并结合小鼠脊髓H&E染色结果，探究三种评分方法的评价准确性、症状敏感性、病情相关性。结果据神经功能评分趋势图，改良15分法后期症状波动更明显。对于非典型性发病EAE，改良15分法和15分法的评分更准确。改良15分法和15分法的发病时间显著早于5分法（P＜0.001），且可反映早期病理改变。改良15分法与高峰期、缓解期病理改变显著相关（高峰P=0.001，缓解P=0.024），15分法与缓解期病理改变相关（P＜0.05）。结论在实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型中，改良15分法能有效进行细化评分，更准确地评估各时期神经功能改变。

多发性硬化 实验性自身免疫性脑脊髓炎 神经功能评分方法

实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是国际上公认的多发性硬化（multiple sclerosis，MS）的理想动物模型，因能复制出与MS相似的临床表现和病理特征而被广泛应用，并成为研究MS发病机制和药物治疗临床前试验的重要手段［1-4］。

典型慢性EAE小鼠模型主要表现为运动功能障碍，对其据神经功能评分标准量化后所得分数可反映患病程度。但针对此EAE模型，目前仍没有统一的神经功能评分方法，常用的评分标准有Kono’s 5分法、Hooper’s 7分法和Weaver’s 15分法［5-6］。其中又因Hooper’s 7分法被多次更改，而最常用Kono’s 5分法和Weaver’s 15分法。但由于5分法适用面受限且评分不够细化、15分法的评分标准表述缺乏精准性，导致两种方法的对模型病情反映欠准确、对病情变化反映欠敏感。因此，本研究基于对EAE模型的长期观察提出了改良15分法。本文从评分方法的评价准确性、症状敏感性、病情相关性三个方面对Kono’s 5分法，Weaver’s 15分法和改良15分法进行探究，并提出EAE模型的相对最适神经功能评分方法。

1　材料与方法

1.1实验动物 8～10周龄的C57BL/6雌性小鼠，体重18到20 g，购自中山大学实验动物中心（广东），饲养于中山大学实验动物中心。

1.2EAE模型制备 C57BL/6小鼠饲养1周后用于实验，记为第0天。32只8～10周龄的C57BL/6雌性小鼠随机分为正常对照组（15只）、造模组（17只）。第0天，将100 μL 2mg/mL MOG33-35（MEVGYRSPFSRVVHLYRNGK，西安联美多肽有限公司）和100 μL弗氏完全佐剂（complete freund’s adjuvant，CFA；美国Sigma公司）混合制成乳剂，多点皮下注射于造模组制备EAE模型；同时正常对照组皮下注射磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）。第0天及第2天，造模组腹腔注射百日咳毒素（pertussis toxin，PTX；美国Sigma公司）300 ng/只。第7天，造模组再次注射乳剂进行二次免疫，造模方法同上；对照组附以PBS注射作对照。

1.3神经功能评分标准

1.3.1Kono’s 5分法 5分法（Kono，1988）［5-6］按照症状严重程度分为5个级别：0分为不发病；1分为尾巴无力；2分为后肢无力；3分为后肢瘫痪；4分为前肢瘫痪；5分为死亡。

1.3.2Weaver’s 15分法 15分法（Weaver，2005）［5-6］是对小鼠尾巴和四肢进行评分，再将得到的5个分数累加即得到总分。对于尾巴，0分表示无症状，1分表示尾巴半瘫，2分表示尾巴全瘫；对于四肢，0分表示无症状，1分表示无力或步态改变，2分表示肢体轻瘫，3分表示肢体全瘫。如此，发病最重的小鼠即尾巴全瘫和四个肢体全瘫则应评为14分（2’+3’×4），15分则表示死亡。

1.3.3改良15分法改良15分法是本研究基于Weaver’s 15分法做进一步细化，将小鼠尾巴和四肢进行评分，再将得到的5个分数累加即得到总分。对于尾巴（见图1），0分表示无症状，0.5分表示比正常稍低，1分表示与地面平行，1.5分表示尾尖拖地，2分表示全尾拖地；对于肢体，0分表示正常，0.5分表示四肢掌外翻，1分表示四肢掌外翻且身体相应部位稍压低，1.5分表示四肢掌外翻且身体相应部位几乎贴地，2分表示轻瘫（行走时有关节活动），3分表示全瘫（肢体不能活动，行走时拖着肢体）。如此，发病最重的老鼠即尾巴全瘫和四个肢体全瘫则评为14分（2’+3’×4），15分则表示死亡。

1.4评分方法 神经功能评分方法严格遵循双人双盲原则，于每日9点对32只小鼠进行观察评分，对每只老鼠使用两种评分方法，且同一小鼠的两次评分时间差控制在20 min以上。

1.5病理改变分析 动物取材时间及数量：①发病初期：EAE组小鼠（5分法评分=0，15分法、改良15分法评分=0.5）及正常组小鼠各3只；②发病中期：主发症状不同的EAE组小鼠（分别以“前肢轻瘫”和“后肢无力”为主）各1只；③发病高峰期：EAE组小鼠、正常组小鼠各9只；④疾病缓解期：EAE组小鼠、正常组小鼠各3只。

动物取材方法：用戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉小鼠，剖开胸腔，暴露心脏，经左心室刺入注射器，剪开右心耳，灌注生理盐水，冲洗血液至肝脏变白后，改用4%多聚甲醛先快后慢灌注固定0.5～1 h，然后取出腰骶段脊髓浸入4%多聚甲醛液中固定24 h。滤纸将组织表面的多聚甲醛吸干后制作石蜡切片，厚度为5 μm。进行后续H&E染色，光镜下观察炎性细胞浸润。

H&E染色评分标准：参照Racke的病理分度标准（400倍镜下计数）［7］—0分：没有炎症细胞；1分：少量散在的炎症细胞；2分：在血管周围组织见炎性浸润；3分：见大量血管套现象并向邻近组织延伸，或者组织炎性浸润但不伴有血管套现象。

1.6统计学方法 采用SPSS 20.0进行统计分析，实验数据以（±s）表示。三种评分方法与病情的相关性分析采用Pearson相关系数。检验水准α= 0.05。

2　结果

2.1三种评分方法评价准确性比较

2.1.1神经功能评分总体趋势 EAE组小鼠全部发病，表现为食欲不振，体重减轻，精神萎靡，步态失常，活动减少，并伴有不同程度的尾巴无力、四肢无力等症状。由神经功能评分曲线图（见图2）可得：①第4至6天，EAE组逐渐起病；15分法、改良15分法的平均症状评分=0.5，而5分法的平均症状评分仍为0（5分法的最小有症状评分为1分）；②第7天开始，EAE组小鼠全部患病；③第17天，EAE组小鼠病情达峰，且改良15分法的症状峰值最明显；④第17至35天，EAE组病情趋于稳定；⑤与5分法和15分法相比，改良15分法后期症状评分波动较为明显，能更准确地反映模型病情的变化。

图2　三种评分方法评分与免疫天数曲线图

2.1.2EAE模型特例的症状描述EAE模型的典型发病模式为“尾部—后肢—前肢”。而第18天EAE组出现1只非典型性发病小鼠，其呈现“尾部—前肢”的疾病进展模式，即仅有尾巴无力、前肢轻瘫，运动障碍症状未波及后肢等其他部位。取此鼠（以“前肢轻瘫”为主）与同组常规发病鼠（以“后肢无力”为主）的全段脊髓做病理H&E染色，对比二者炎症浸润最明显脊髓节段的病理情况。结果显示，与正常对照（见图5）相比，两只EAE鼠脊髓白质均见明显的炎性浸润（见图3）；而对比两只“5分法得分各异、15分法与改良15分法得分相同”的EAE鼠（见表1），H&E染色结果未出现明显差异。

表1　三种神经功能评分方法的神经功能评分比较

由此说明，对于非典型性发病的EAE模型，与5分法相比，15分法和改良15分法的症状描述准确性较高。

2.2三种评分方法症状敏感性比较

2.2.1EAE模型发病时间基于三种神经功能评分标准，15分法与改良15分法的发病时间（均为4.20±0.25 d）比5分法的发病时间（6.30±0.37 d）显著提前，差异有统计学意义（P＜0.001；见图4）。结果说明与5分法相比，15分法与改良15分法更有利于早期发现EAE模型的症状改变。

2.2.2EAE模型发病早期病理改变为进一步探究三种评分方法对EAE模型早期症状发现的敏

图3　主发症状不同的EAE模型脊髓（炎症浸润最明显节段）病理切片（HE，400×）

图4　三种神经功能评分方法的发病时间（***表示与5分法相比，P＜0.001）

图5　EAE模型（15分法、改良15分法=0.5，5分法=0）与正常组腰骶段脊髓病理切片（HE，400×）

2.3三种评分方法病情相关性比较

2.3.1发病高峰期三种评分方法的病情相关性比较根据三种神经功能评分标准，预实验结果显示改良15分法的发病高峰时间（17.00±0.98）d迟于5分法的高峰时间（15.20±0.89）d、15分法的高峰时间（13.50±1.06）d，差异有统计学意义（P＜0.01，见图6）。

图6　三种神经功能评分方法的发病高峰时间（###表示与5分法、15分法相比，P＜0.001）

基于上述结果，分别于第14、15、17天（分别对应15分法、5分法、改良15分法的高峰期）取小鼠腰骶段脊髓进行H&E染色观察，并参照Racke的病理分度标准评分。再据三种评分方法高峰期评分与脊髓病理评分进行Pearson相关分析（见表2）显示，5分法、15分法与病理评分相关性无统计学意义（P＞0.05），改良15分法与病理改变显著相关（P=0.001，γ=0.709）。

表2　三种神经功能评分方法的病情相关性比较（高峰期）

2.3.2疾病缓解期三种评分方法的病情相关性比较免疫后第35天取小鼠腰骶段脊髓进行H&E染色观察，并参照Racke的病理分度标准评分。再据三种评分方法高峰期评分与脊髓病理评分进行Pearson相关分析（见表3）显示，5分法与病理感性，免疫后第4天处死EAE组（15分法、改良15分法评分=0.5，5分法评分=0）与正常对照组小鼠各3只，并取腰骶段脊髓做H&E染色观察病理改变。如图5所示，与正常小鼠相比，EAE组可见脊髓白质炎症细胞浸润。这进一步说明与5分法相比，15分法和改良15分法对早期症状的发现更敏感。评分相关性无统计学意义（P＞0.05），15分法、改良15分法均与病理改变显著相关（P＜0.05）。

表3　三种神经功能评分方法的病情相关性比较（缓解期）

3　讨论

EAE模型作为研究多发性硬化的主要动物模型被广泛使用，但目前对其仍没有统一的神经功能评分方法。其中最常用的评分方法包括Kono’s 5分法、Hooper’s 7分法以及Weaver’s 15分法。而对于Kono’s 5分法又描述各异［8-9］，7分法也被改进成8分法、9分法等［10-11］。这些方法都有其存在的合理性，但由于缺少统一且行之有效的评分标准而造成了学术交流的不便。因此，本研究在15分法的基础上做出改良，并对5分法，15分法和改良15分法在EAE模型的应用情况进行比较，试图找到最适评价标准。

多发性硬化症病灶具有时间多发性，其动物模型EAE也具有复发—缓解的特点。本研究显示，对比常用的5分法和15分法，评分标准经过合理细化的改良15分法可以更准确地评估EAE模型症状的波动情况。多发性硬化症病灶还具有空间多发性，其动物模型EAE的起病部位也并不固定，因此5分法的模型适用范围严重受限。如本研究中出现的非典型性发病模型（以“前肢轻瘫、后肢不受累”为主发症状）与同期常规型发病模型（以“后肢无力”为主发症状）相比，二者病理改变评分并无统计学差异，但用5分法评价得到的神经功能评分却出现了较大的区别。这充分说明了5分法没能有效地考虑EAE模型病灶有空间多发性的特点。而改良15分法和15分法采用分数累加的计分方法，尤其是改良15分法又做了进一步的评分细化，这很有效的解决了病灶随发导致行为表现差异的问题。

此外，改良15分法和15分法的早期症状发现敏感性显著优于5分法。如图4所示，改良15分法和15分法的发病时间明显早于5分法，差异有统计学意义。且病理分析也验证了改良15分法和15分法早期发现的准确性。在药物治疗临床前试验中，15分法，尤其是评分细化后的改良15分法在研究药物对EAE模型早期变化的有效性方面具有显著的优势。

同时，我们也对三种评分方法的与病理改变的相关性进行了研究。结果表明，在EAE缓解期，改良15分法和15分法与病理改变显著相关。这在关于多发性硬化症缓解复发过程的研究具有显著优势。而在EAE高峰期，改良15分法与病理改变显著相关，15分法和5分法与病理评分相关性无统计学意义。高峰期在关于EAE模型的研究中是一个常用于观察的病理阶段，一般的研究中该阶段的确定主要是通过神经功能评分方法评分结果来确定，所以，该时期神经功能评分方法评分是否准确十分重要。所以，我们有理由相信改良15分法在未来的科研工作中会可以发挥巨大的作用。

本研究仍存在一些不足之处。首先，本研究中非典型性发病的模型数量有限，尚未得到更加全面的统计学数据。其次，本研究仅仅对将改良的15分法与常用的5分法和15分法进行比较，没有将其与常用的7分法进行比较，不能客观得出改良15分法优于其他所有神经功能评分方法。最后，改良15分法是我们根据前人的努力成果以及实验经验而提出的，相比5分法和15分法都有了较大的提高，但它仍然还有进一步提高的空间。希望其他科研工作者也能对此进行研究，分享经验，提出更加准确、敏锐、病理相关性更好的评分方法。

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A comparison study of three neurological assessments in the animal model of multiple sclerosis.

MA Ke，CHEN Xiong，ZHENG Junjiong，CHEN Jiacheng，FENG Yanqing.Department of Neurology，First Affiliated Hospital，Sun Yat-Sen University，Guangzhou，510080，China.Tel:020-87755766.

Objective To evaluate the effectiveness of three neurological assessments in experimental autoimmune encephalomyelitis.Methods Thirty-two female C57BL/6 mice（18-20g）were randomly divided into normal group（n=15）and immune group（n=17）.Immune group were induced subcutaneously in the flank by emulsion consisted of MOG33-35and complete Freund’s adjuvant.Mice were assessed by two investigators for 35 days after immunization in a blinded manner using Kono’s 5-point criterion，Weaver’s 15-point criterion and improved 15-point criterion.Based on H&E staining，we analyzed the accuracy，sensibility and dependency of three assessments.Results 35-day clinical-score plots revealed that the fluctuation of symptoms was more obvious in improved 15-point criterion compared with the other two criteria.15-point criterion and improved 15-point criterion are more accurate than 5-point criterion in atypical-onset EAE.15-point criterion and improved 15-point criterion could detect the neurological deficits much earlier than 5-point criterion（P＜0.001）.Neurological scores assessed by improved 15-point were well correlated with the pathological findings during the peak and remission stage.Conclusion Improved 15-point criterion is better neurological score system than Kono’s 5-point criterion and Weaver’s 15-point criterion because of its accurate assessment of the neurological deficits in experimental autoimmune encephalomyelitis.

Multiple sclerosis Experimental autoimmune encephalomyelitisClinical assessment criterion

R744.51

A

2014-11-07）

（责任编辑:李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2015.11.008

*中山大学附属第一医院神经内科（广州510080）