方勇 肖娟 刘重元 张志伟

摘要 ：目的：观察LMP1羧基末端活性区3（CTAR3）在鼻咽癌干细胞迁移与侵袭中的作用。方法：首先建立LMP1和CTAR3缺失突变型LMP1（LMP1△252-351）的鼻咽癌干细胞SP18细胞系（SP18-LMP1和SP18-LMP1△252-351）；然后观察LMP1和LMP1△252-351对SP18细胞迁移与侵袭的影响。结果：SP-LMP1△252-351细胞的迁移与侵袭能力较SP-LMP1细胞显著降低（n=3，P<0.05）。结论：LMP1羧基末端CTAR3是其促鼻咽癌干细胞迁移与侵袭的重要功能活性区域。

关键词：鼻咽癌干细胞；LMP1；迁移与侵袭

基金项目：湖南省自然科学衡阳联合基金（No.12JJ9033）；湖南省科技厅项目（No.2013SK3118、2014SK3081）；湖南省高校创新平台基金（No.10K052、12K094、13K083）；衡阳市科技局项目（No.2013KJ12、2013KJ28）

Abstract： Objective Observed the role of carboxy terminal activating region 3（CTAR3） of latent membrane protein 1（LMP1） in process of migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma stem cell. Methods The SP18 cell of stable expressed LMP1 and deletion mutant type LMP1 （LMP1△232-351） were established （SP18-LMP1and SP18-LMP1△252-351）. The effect of LMP1 and LMP1△232-351 for cellular migration and invasion were observed in SP18 cells. Results The migration and invasion of SP-LMP1△252-351 cells was obviously decreased to compare with SP-LMP1 cells （n=3， P<0.05）. Conclusion The LMP1-CTAR3 is important carboxy terminal activating region to promote migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma stem cell SP18 cell.

Keywords： nasopharyngeal carcinoma stem cell， LMP1， migration and invasion

潛伏性膜蛋白1（latent membrane protein，LMP1）是EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）编码的具有促细胞癌变和转移作用的瘤蛋白[1]，该蛋白的羧基末端有三个功能活性区域（carboxyl terminal activating region，CTAR），即CTAR1、CTAR2和CTAR3，它们是诱导细胞恶性转化过程中的重要功能活性位点[2]。肿瘤干细胞决定肿瘤发生、发展和转移，被认为是肿瘤发生和复发的根源[3，4]。至今，LMP1 在鼻咽癌干细胞转移中的作用仍不十分清楚。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1 质粒 逆病毒质粒pLNSX-LMP1（含全长1.95kb野生型LMP1）和pLNSX-LMP1△232-351 （CTAR3缺失，含1.59kb的LMP1）由中南大学肿瘤研究所贺智敏教授惠赠[5，6]。

1.1.2 细胞 鼻咽癌干细胞SP18细胞株[7]由中山大学肿瘤防治中心惠赠，该细胞用含5%小牛血清（购自杭州四季青公司）的DMEM（Gibco BRL公司）培养。

1.1.3 试剂 Matrigel基质胶（5mg/ml）为BD公司产品，Transwell小室（3428型）为Corning公司产品。单克隆抗体（一抗和二抗）购自Zymed Ltd，AMV Reverse Transcription 试剂盒购自Promega公司，G418和Liperfect2000脂质体购自invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1 建立稳定表达LMP1和LMP1△232-351的SP18细胞 将SP18细胞种于6孔板中，分别用RV-LMP1和RV-LMP1△232-351逆病毒（加入8mg/L聚凝胺）37℃孵育SP18细胞2次（3～4 h/次，间隔8～12 h/次），然后400μg/ml G418筛选2周，汇合克隆扩大培养，建成稳定表达LMP1和LMP1△232-351的转染细胞系（SP18-LMP1和SP18-LMP1△232-351），用细胞免疫荧光检测LMP1的表达。

1.2.2细胞免疫荧光实验 制备……