张永利等

摘要：以珠美海棠幼苗根系的cDNA为模板，根据珠美海棠NHX1（GQ503257）的保守序列设计引物，通过 RT-PCR 扩增得到目的基因全长1 865 bp，包含1个1 635 bp的开放阅读框，编码544个氨基酸，其核苷酸序列与苹果（GU338395）、玫瑰（KC188664）、杨树（ACU01853）的核苷酸序列同源性分别是95%、93%、91%。其对应的氨基酸序列与拟南芥（AAF21755）、玫瑰（BAD93487.1）和大叶补血草（BAB11940）液泡型Na+/H+逆向转运蛋白的氨基酸序列的同源性分别是79%、87%、79%，说明该蛋白是一种定位于液泡膜的Na+/H+逆向转运蛋白，该基因属于液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因。它编码的蛋白质分子量为60.5 ku，理论等电点（pI）为8.85，二级结构主要由α-螺旋、β-折叠和不规则卷曲构成，其N-末端具有12个跨膜疏水片段，C-末端具有亲水的长链尾巴，在跨膜片段内含有氨基酸保守序列85-LFFIYLLPPI-94，是Na+/H+逆向转运蛋白抑制剂氨氯吡嗪咪的结合位点。

关键词：珠美海棠；Mz2NHX1基因；克隆；生物信息学；耐盐机理

中图分类号： Q785；S685.120.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0020-05

盐害是影响植物生长发育和农作物产量的主要限制因子之一，它对植物的伤害表现为离子不平衡、水分亏缺和离子毒害[1]。土壤中过多的Na+导致植物细胞的膜功能失调、代谢活动衰减及其他次生影响，使植物生长受到抑制，直至细胞死亡[2-3]。为避免盐的毒害作用，植物形成了特殊的耐盐机制，即限制Na+吸收、增加Na+外排及Na+区隔化[4]。这3种途径主要与细胞质膜上和液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白有关。编码质膜Na+/H+逆向转运蛋白的基因首先从酵母中克隆得到[5]，随后从拟南芥中克隆到SOS1[6]，SOS1基因与真菌中编码质膜Na+/H+逆向转运蛋白的基因有很高的同源性，并且SOS1基因的突变体对盐胁迫非常敏感，盐胁迫可以增SOS1基因的表达，说明SOS1在拟南芥的耐盐机制中起重要作用。由于Na+/H+逆向转运蛋白可以将Na+外排或区隔化到液泡中，因此它们在维持细胞渗透平衡中具有重要作用[7]。在植物中，液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白（NHX1）的活性最初在甜菜碱储藏组织的液泡形成体的小泡囊中观察到，后来从拟南芥、水稻和冰叶日中花中分别克隆了液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因AtNHX1[8]、OsNHX1[9]和McNHX1[10]，并且发现盐胁迫可以增加它们的表达，说明NHX1基因在植物的耐盐机制中起关键作用。因此通过研究Na+/H+逆向转运蛋白基因的耐盐机理，可以为培育优良的耐盐种质资源提供理论依据。

珠美海棠为蔷薇科（Rosacaeae）苹果属（Malus）多年生木本植物，有较高的应用价值。该树种耐盐碱、抗寒能力强，在盐碱地较重的地区可作砧木嫁接苹果，成活率较高。它在含盐量0.6%、pH值9.2的土壤中也能正常生长[11]。推测这种高度的耐盐能力与植物的耐盐基因有关。

关于植物的Na+/H+逆向转运蛋白基因的研究已有很多报道，但是对珠美海棠的相关研究报道很少。笔者在前期研究（GQ503257）的基础上，以珠美海棠组培生根苗为试材，克隆了珠美海棠NHX1的同源基因Mz2NHX1，并对Mz2NHX1基因进行了序列分析和生物信息学分析，旨在为研究该基因的功能、探讨珠美海棠的耐盐机制奠定基础，同时也为耐盐基因的利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

珠美海棠[Malus zumi （Matsum.） Reder]组培生根苗，由天津农学院果树学重点实验室提供。Recombinant DNase Ⅰ（RNase-free）、Ribonuclease Inhibitor、Oligo d（T）18 Primer、Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）、TaKaRa Ex Taq、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0购自TaKaRa公司；RNase/DNase Free枪头、RNase/DNase Free离心管、Ampicillin、X-gal、IPTG、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Marker购自天根生化科技（北京）有限公司；克隆载体试剂盒 pEASY-T1 Cloning Kit 和大肠杆菌感受态Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell购自北京全式金生物技术有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，DNA测序由华大基因有限公司完成。其他药品均为分析纯，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2方法

1.2.1珠美海棠总RNA提取和反转录取0.1 g珠美海棠幼苗根系，用改良的CTAB法提取RNA，并用DNaseⅠ处理去除DNA污染，电泳检测其质量；利用微量紫外分光光度计（NANODROP 2000）测定RNA浓度，根据宝生物反转录酶说明书取适量M-MLV酶和RNA进行反转录，合成cDNA第一链，-80 ℃保存备用。

1.2.2引物设计与目的基因的扩增根据已克隆的珠美海棠NHX1基因的保守序列，设计1对特异引物P1：5′-AGGAGGCGGATACAATGGCT-3′和P2：5′-CAACCGATGTGCTTGGGAC-3′，利用RT-PCR反应扩增目的基因的全长序列。根据全长序列设计特异引物P3：5′-CGGGGTACCCCGATGGCTGTTCCACATTTG-3′和P4：5′-CCGGAATTCCGGTTGCCACTGAACGTTGTTG-3′，扩增目的基因的开放阅读框序列。扩增体系（20 μL）：10×Ex PCR buffer 2.0 μL，dNTP Mix 1.6 μL，引物P1和引物P2各0.8 μL，cDNA模板1.5 μL，Ex Taq 0.1 μL，DEPC-d2H2O 13.2 μL。反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55.3 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，后延伸10 min，30个循环，4 ℃短暂保存。endprint

1.2.3目的片段的检测与鉴定使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit回收目的片段，将目的片段与pEASY-T1载体连接15 min，然后转化大肠杆菌感受态细胞，整个过程要轻柔。在不含Amp的LB液体培养基中37 ℃条件下、200 r/min摇菌1 h，然后在含有IPTG和X-gal的 LB（+Amp） 固体培养基上37 ℃恒温培养过夜。挑取白色单菌落至LB（+Amp）液体培养基中，在37 ℃、200 r/min下摇菌培养8 h，以菌液为模板做PCR，鉴定阳性重组子。提取质粒，通过双酶切法（EcoRⅠ，KpnⅠ）鉴定目的片段是否成功连入载体，用鉴定正确的质粒送华大基因公司测序。

1.2.4目的基因的生物信息学分析利用NCBI的BLASTn和BLASTp进行核苷酸及氨基酸序列相似性分析；采用DNAMAN软件进行多序列比对，并预测蛋白质的疏水性和亲水性，采用MEGA 5.0软件进行系统进化树分析；利用TMpred在线准确预测跨膜蛋白的跨膜片段，利用TMHMM在线对目的基因进行跨膜结构域的预测；采用ProtParam软件分析蛋白质的理化性质。

2结果与分析

2.1珠美海棠Mz2NHX1基因的克隆和测序分析

用质量分数1%的琼脂糖凝胶检测从珠美海棠中提取的RNA质量，总RNA基本无降解，无蛋白质污染，28 S、18 S和5 S条带完整。RNA反转录为cDNA第1条链后，以cDNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增得到1条1865 bp的目的条带（图1），与苹果（GU338395）、玫瑰（KC188664）、杨树（XM_002307158）的核苷酸序列的同源性分别为95%、93%、91%。通过NCBI的ORF Finder在线分析，预测开放阅读框长1 635 bp。根据该核苷酸序列设计引物P3、P4，PCR扩增出其开放阅读框序列（图2），经与pEASY-T1连接、转化、蓝白斑筛选，菌液PCR和酶切鉴定后测序，得到1 635 bp的核苷酸序列，测序结果与预测序列吻合，我们将该基因命名为Mz2NHX1。

2.2珠美海棠Mz2NHX1基因的生物信息学分析

2.2.1Mz2NHX1氨基酸序列分析经 NCBI 的 ORF Finder在线软件分析，Mz2NHX1基因开放阅读框长 1 635 bp，编码1

个由 544 个氨基酸组成的蛋白 Mz2NHX1（图3）。

通过Protparam在线分析可知，Mz2NHX1蛋白的分子质量为60.5 ku，等电点（pI）为8.85，分子式为C2802H4377N699O749S20。用DNAman软件分析发现，珠美海棠与拟南芥（AAF21755）、大叶补血草（BAB11940）和玫瑰（BAD93487.1）等液泡膜 Na+/H+ 逆向转运蛋白的氨基酸序列有较高的同源性，分别为79%、79%和87%，并且含有保守序列85-LFFIYLLPPI-94，是Na+/H+逆向转运蛋白抑制剂氨氯吡嗪咪的结合位点；以及钙调素类蛋白（AtCaM15）的结合位点的氨基酸保守序列515-RKFDNAFMRPVFGGRG-536（图4）。

用MEGA 5.0软件对珠美海棠Mz2NHX1编码的氨基酸与拟南芥、水稻及牵牛花、番杏、玫瑰、杨树的Na+/H+逆向转运蛋白的氨基酸序列进行了进化树分析。结果（图5）发现，Mz2NHX1与苹果（ADB92598）和玫瑰（BAD93487）的 Na+/H+ 逆向转运蛋白的氨基酸序列同源性达100%，而与牵牛花同源性达95%，与番杏和杨树的同源性为 90%，与水稻的同源性为86%，亲缘关系比较近。以上植物的NHX基因编码蛋白均定位在液泡膜上，推测Mz2NHX1也是定位于液泡膜上。其主要功能是将过量的Na+区隔入液泡，避免Na+积累对细胞造成离子毒害，降低细胞渗透势提高植物吸收水分的能力，抵御盐胁迫对植物的渗透胁迫。

2.2.2Mz2NHX1基因编码蛋白的理化性质对Mz2NHX1编码的蛋白进行分析发现，该蛋白编码544个氨基酸，包含参与生物组成的所有氨基酸。用DNAman软件分析，Mz2NHX1蛋白分子量为60.5 ku，等电点（PI）为8.85。由疏水性分析（图6）可知，Mz2NHX1蛋白N-末端有12个跨膜疏水区域和1个较长的C-末端亲水性尾巴。用TMHMM Server v.2.0在线软件对其跨膜区域（图7）进一步预测表明，Mz2NHX1的

N-端面向细胞质，推测N-端的疏水区域可能含有与Na+结合的重要氨基酸残基，并且可以形成跨膜螺旋，几乎全部存在于液泡内的C-端亲水尾巴可能在对Na+和K+的选择性吸收过程中发挥调节作用。研究发现，将拟南芥AtNHX1的亲水C-端去掉后，则可导致Na+/H+运输的相对比率增长[12]。因此，NHX1的跨膜结构和亲水尾巴可能在Na+的转运过程中起着重要作用。

2.2.3Mz2NHX1蛋白结构分析利用PORTER在线预测Mz2NHX1编码蛋白的二级结构，结果表明，Mz2NHX1蛋白由47.43%的α-螺旋、17.16%的β-折叠片、3.68%的β-转角和31.80%的无规则卷曲组成（图8）。

3讨论与小结

植物Na+/H+逆向转运蛋白是一种电中性转运蛋白，不同植物中的该蛋白的N-末端具有高度同源性，该端是负责Na+转运的区域，对Na+的竞争性抑制剂氨氯吡嗪脒及其衍生物敏感，C-末端是亲水性长链尾巴，位于细胞质或液泡囊腔内，此结构域内含有多个蛋白激酶作用位点，能与钙调素结合，参与启动多种信号的反应，是调节活性的区域 [13]。

有研究将AtNHX1基因在拟南芥上进行过量表达，结果发现转拟南芥植株在200 mmol/L NaCl溶液浇灌下能正常生长发育[8]。将AtNHX1基因转入番茄中，过量表达AtNHX1基因的转基因番茄在200 mmol/L NaCl浓度中能够正常开花和结实，但是叶片中Na+浓度高于果实中Na+浓度 [14]。这些结果表明，转单一的Na+/H+逆向转运蛋白基因能够明显提高植物耐盐性，其原因可能是Na+/H+逆向转运蛋白基因导入植物细胞后，激活了一系列与耐盐相关的基因，从而明显提高植物的耐盐性，说明Na+/H+逆向转运蛋白基因属于耐盐关键基因。因此，在利用转基因技术培育耐盐品种中有很高的应用价值。endprint

本研究通过将Mz2NHX1编码的Mz2NHX1与已知Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列的同源性对比及系统发育分析，认为Mz2NHX1是一种定位于液泡膜的Na+/H+逆向转运蛋白，与拟南芥（AAF21755）、大叶补血草（BAB11940）和玫瑰（BAD93487.1）等液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的氨基酸序列有较高的同源性，分别为79%、79%和87%，因此，

Mz2NHX1基因属于液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因。对Mz2NHX1核酸序列所翻译的蛋白序列预测发现N-末端含有12个跨膜疏水区域和1个较长的C-末端亲水性尾巴。对该蛋白质二级结构预测分析可知，Mz2NHX1由47.43%的α-螺旋、17.16%的β-折叠片、3.68%的β-转角和3180%的无规则卷曲组成。

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