翁金月　樊建霜王蓉蓉　俞志敏

赶黄草与黄芩不同配比对病毒性肝炎C3H/HeJ小鼠的影响

翁金月樊建霜★王蓉蓉俞志敏

目的 本文拟建立成熟慢性病毒性肝炎的动物模型，探讨赶黄草与黄芩不同配比对病毒性肝炎的影响，为临床用药提供实验依据。方法 建立C3H/HeJ小鼠病毒性肝炎模型，采用试剂盒检测模型组、赶黄草组、黄芩组、赶黄草配黄芩1∶1组、1∶2组、1∶3组各给药组小鼠血清ALT、AST、STB、TP指标的含量变化以及采用光学显微镜观察模型组和各给药组小鼠肝脏的形态学改变；采用免疫组织化学图像分析法测定各组肝组织COX-2的表达。结果 与空白组比较，模型组的肝组织呈炎性病理改变，肝脏指数显著降低，血清中ALT、AST、STB含量显著升高，TP含量显著下降。与模型组比较，赶黄草组、赶黄草配黄芩1∶1组、1：2组、1∶3组小鼠肝组织炎症、纤维化等明显减轻，血清中的AST、ALT、STB含量显著降低；赶黄草组、赶黄草配黄芩1∶1组、1∶2组血清TP含量显著升高。COX-2的表达结果显示，空白组肝细胞仅见少量阳性表达，与空白组比较，模型组肝组织中COX-2的表达显著增强；与模型组比较，各治疗组肝组织中COX-2表达均明显低于模型组，其中赶黄草配黄芩1：2组的表达最弱。结论 赶黄草能显著改善小鼠肝炎的病变，黄芩有改善其炎性病变的趋势，二者配伍后，尤其当黄芩2倍于赶黄草时，能显著缓解其肝炎病变，其机制可能与降低COX-2的表达有关。提示临床治疗病毒性肝炎用药，黄芩2倍用量于赶黄草效果最佳。

赶黄草 黄芩 配伍 病毒性肝炎

现代研究表明，赶黄草具有清热解毒、退黄化湿、活血散瘀、利水消肿的功效，其有效成分没食子酸和槲皮素等具有抗乙肝病毒和保肝作用，临床上可用于酒精性肝损伤，乙型肝炎等的治疗［1］。黄芩具有保肝、利胆、抗肝炎病毒的药理作用，常用作病毒性肝炎的辅助用药。作者通过采用3型鼠肝炎病毒（MHV-3）感染C3H/HeJ小鼠，建立成熟的具有病毒感染过程的慢性病毒性肝炎模型［2］，比较其与赶黄草治疗组、黄芩治疗组、赶黄草与黄芩不同配比治疗组小鼠血清生化指标以及肝组织COX-2表达的变化，研究赶黄草与黄芩配伍对于改善慢性病毒性肝炎的理论基础，为临床合理治疗提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料 （1）动物：6～8周SPF级C3H/HeJ小鼠，雌性，由温州医科大学实验动物中心提供。喂养2周可用于实验。（2）试剂：纯化鼠3型肝炎病毒（MHV-3病毒），液氮保存，浓度为106 PFU/ml。天门冬氨酸氨基转移酶（AST）测定试剂盒、丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定试剂盒、总蛋白（TP）试剂盒、总胆红素（STB）试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；兔抗人单克隆COX-2抗体、DAB显色试剂盒、HE染色剂、Masson三色染色剂均购自武汉博士德；生理盐水购自浙江民生药业有限公司。（3）仪器：全自动生化仪（日本日立）；BP211D 万分之一电子分析天平（德国Sartorius）；CX21 型显微镜（日本OLYMPUS）；酶标定量测定仪（Thermo Multiskan AsCant公司）；离心机（上海医疗器械厂）；Image-Pro Plus 5.0 图像分析软件（美国Media Cybernetics）；YB-6D型生物组织石蜡包埋机（湖北亚光有限公司）。（4）药材：赶黄草、黄芩（均购于浙江温州新特医药有限公司），赶黄草经作者鉴定为虎耳草科扯根菜属植物赶黄草的干燥地上部分；黄芩为唇形科植物黄芩的干燥根。

1.2方法 （1）造模：取 C3H/HeJ小鼠70只，体质量18～22g，按体重随机分为空白组、模型组、赶黄草组、黄芩组、赶黄草配黄芩1：1组、1：2组、1：3组，共7组，各10只，将纯化MHV-3 病毒进行稀释，以10PFU/200μl对模型组及各给药组小鼠进行腹腔注射，观察肝脏组织形态学以及各组血清生化指标的变化。（2）药液制备：①赶黄草、黄芩药液制备： 取赶黄草、黄芩各50g，分别加10倍水浸泡30min，武火煮沸，文火继续煎煮20min，过滤，减压浓缩至100ml，最终浓度为0.5g/ml。②赶黄草与黄芩不同配比各组药液的制备： 取赶黄草3份，各50g，基于①的制备条件，分别加入黄芩50g、100g、150g制备成100ml药液，最终浓度分别为1.0g/ml、1.5g/ml、2.0g/ml。将上述药液分装，置-20℃冷冻，备用。

1.3药物治疗及标本采集 小鼠于病毒感染15d后，给药组每只小鼠按10ml/kg 药物灌胃，空白组和模型组给予同体积生理盐水，连续给药5d，2次/d，早晚各1次，末次给药60min后，眼眶取血，静置30min后以3000 r/min离心10min，收集上清血清，-20℃冻存备用，采血后以颈椎脱臼法处死小鼠，快速取出部分肝脏组织，以10%中性福尔马林固定，切片，HE染色法观察肝脏病理的总体形态变化，Masson三色染色法观察胶原、网状纤维在纤维化形成过程中的变化及判断肝纤维化程度，置于光学显微镜下观察并拍照。

1.4肝组织COX-2蛋白水平的表达 将小鼠肝组织固定24h，脱水、石蜡包埋切片，置玻片上烘干，脱蜡，梯度酒精补水，分别以蒸馏水和PBS缓冲液冲洗；再将切片放入枸橼酸盐缓冲液中加热至沸腾，停沸5min，再重复2次，冷却后以PBS冲洗3次，每次5min，滴加50μl 3%过氧化氢，室温孵育10min，PBS冲洗，滴加50μl非免疫性动物血清，室温孵育，10min后弃去血清，加COX-2一抗孵育2h后加入50μl生物素标记二抗，室温孵育20min，再滴加50μl链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液，孵育20 min，冲洗，滴加100μl DAB显色液，显色反应3～10 min，脱水之后封片即可。以Image-Pro Plus 5.0医学图像分析软件检测每组细胞阳性染色的IOD值，每张图片选取5个IOD值的均值表示COX-2表达的相对量。

1.5统计学处理 采用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1一般情况及肝组织形态变化 小鼠感染MHV-3病毒4～6d便开始出现精神不振，并伴有食欲减退；感染后15d进入稳定期。造模小鼠肉眼见肝脏体积略大，表面粗糙，局部有囊肿，空白组小鼠肝脏HE染色后，可见肝小叶结构清晰，肝细胞间连接紧密，肝索排列整齐，肝细胞胞质均匀，门管区无明显炎细胞浸润；而模型组小鼠肝脏HE染色后可见不同程度损伤，有的表现为肝细胞水肿，胞质疏松，以中央静脉周围为主，肝索排列拥挤、紊乱，偶见点状或小灶坏死，门管区见淋巴细胞浸润等炎症改变，严重者表现为肝脏萎缩，但肝脏组织结构基本完整，在门管区和小叶中央有少量的胶原纤维、小范围片状坏死等；赶黄草组、各配伍组肝细胞的水肿、坏死及炎细胞浸润等形态学改变明显减轻。

2.2对肝脏指数的影响 见表1。

表1　赶黄草与黄芩不同配比对小鼠病毒性肝炎肝指数的影响（±s）

表1　赶黄草与黄芩不同配比对小鼠病毒性肝炎肝指数的影响（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较：△P＜0.05，△△P＜0.01

组别给药剂量（g/kg）肝脏指数（mg/10g）空白组生理盐水5.12±0.23△模型组生理盐水4.33±0.47*赶黄草组55.57±0.20△△黄芩组54.92±0.16△赶黄草配黄芩1：1组104.78±0.32赶黄草配黄芩1：2组155.37±0.15△△赶黄草配黄芩1：3组204.81±0.17

2.3含药血清指标性成分的变化 与空白组比较，模型组小鼠血清中ALT、AST、STB明显升高，TP显著下降；与模型组比较，赶黄草组、赶黄草配黄芩1：1组、1：2组、1：3组小鼠血清中的ALT、AST、STB含量显著降低，黄芩组有降低趋势；对TP的研究中，赶黄草组、赶黄草配黄芩1：1组、1：2组含量显著升高，黄芩组、赶黄草配黄芩1：3组有升高趋势。

2.4肝组织COX-2蛋白表达 肝组织中COX-2的阳性表达以胞浆为主，以胞质内出现棕黄色颗粒（DAB显色）为阳性表达，空白组肝细胞仅见少量阳性表达，模型组肝组织中COX-2的表达明显增强，各治疗组肝组织中COX-2表达均明显低于模型组（P＜0.05），其中赶黄草配黄芩1：2组的表达最弱。

3　讨论

病毒性肝炎是由几种不同的噬肝病毒（肝炎病毒）引起的常见传染病，具有传染性强、发病率高等特点，部分可发展为肝硬化和原发性肝细胞癌，严重危害人类健康。赶黄草主治黄疸、水肿等［3］，虽未被药典收录，但由于其显著的疗效，长期以来是苗族治疗肝病的常用药，被誉为“神仙草”［4］。其有效成分黄酮类、甾体类化合物、有机酸类等均能抑制肝损伤［5］，并对慢性肝炎有显效［6］。黄芩具有清热燥湿、泻火解毒等功效，临床主要用于湿温、黄疸等症［7］。研究发现，黄芩煎剂能显著降低CCl4造模小鼠血清中丙氨酸转氨酶（ALT）和琥珀酸脱氢酶（SDH）活性，且其降低程度与药物剂量呈量效关系，说明黄芩具有良好的保护CCl4致大鼠急性肝损伤的作用［8］。可见赶黄草与黄芩均有护肝作用，研究二者配伍使用能否增强其护肝作用具有一定的实用性，为临床治疗慢性病毒性肝炎提供新的思路。

关于肝炎动物模型方法较多，但均缺乏染病的自然过程，与人类慢性病毒性肝炎的发病过程有较大差异。早期研究发现，采用MHV-3腹腔注射于小鼠体内，建立具有病毒感染过程的慢性病毒性肝炎模型［2］，但敏感Balb/cJ小鼠感染MHV-3后发展为暴发性肝炎，并在5～7d内全部死亡，而耐受A/J小鼠感染MHV-3后则无任何临床症状［9］。C3H/HeJ属于近亲繁殖的小鼠，对MHV-3敏感性适中，且其重复性良好，能弥补其他动物模型的局限性。造模15d后，出现类似于人类慢性病毒性肝炎的表现，血生化检测提示AST、ALT、STB显著升高，且AST/ALT比值＞1，说明小鼠肝已有实质性的损害，同时伴TP下降，提示造模成功。

当肝细胞受损时，胞浆内的ALT与AST释放入血浆，致使血清中转氨酶含量升高［10］。胆红素（STB）是判定黄疸的重要依据，也是肝功能的重要指标［11］，当肝脏病变时，血清中总胆红素升高。本资料结果显示，与模型组比较，赶黄草组、赶黄草配黄芩1∶1组、1∶2组、1∶3组小鼠肝细胞水肿、坏死及炎细胞浸润明显减轻，肝脏指数亦较模型组显著升高；血清中的AST、ALT、STB含量较模型组显著降低，黄芩组仅有降低趋势；以赶黄草及其配伍组的血清中三者含量降低最为显著，提示其能明显缓解肝细胞的损伤从而使肝功能得到恢复。造模成功后，小鼠肝脏合成蛋白质的能力下降，造成TP水平降低。在本研究中，赶黄草组、赶黄草配黄芩1∶1组、1∶2组TP含量较模型组显著升高，黄芩组、赶黄草配黄芩1∶3组有升高趋势，说明赶黄草可使肝脏合成蛋白质能力基本恢复正常。研究发现，环氧合酶（COX）的诱导酶COX-2在正常的肝脏组织中多不表达，但在慢性肝炎、肝硬化中均有表达［12,13］，本资料中，空白组肝细胞仅见少量阳性表达，模型组肝组织中COX-2的表达明显增强，各治疗组肝组织中COX-2表达均明显低于模型组（P＜0.05），其中赶黄草配黄芩1∶2组的表达最弱，说明赶黄草配伍黄芩可能通过降低肝组织COX-2表达减轻MHV-3小鼠模型的肝脏损害。

综上所述，赶黄草配伍黄芩治疗后可以明显改善病毒性肝炎模型小鼠的肝损伤，在各配伍组中，赶黄草与黄芩的配伍比例均有1∶1组、1∶2组、1∶3组，说明其稳定性较好，且赶黄草配伍黄芩1∶2组的作用趋势明显优于1∶1组、1∶3组，提示黄芩2倍用量于赶黄草改善肝损伤的作用最佳。但本研究仅从二者配伍方面考察其作用效果，二者以何化学部位发挥药效的物质基础以及如何发挥作用的机制还需进一步研究。

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Objective To construct the mice model of chronic virus hepatitis and to study the influence of Penthorum，Penthorum and Scutellariae with different proportion on the model of chronic virus hepatitis. Methods All the mice were divided into Penthorum group，scutellariae group，Penthorum with Scutellariae 1∶1group，1∶2 group and 1∶3 group seven different groups，then established the model of C3H/HeJ mice institute of viral hepatitis；Taking use of kits to detect the content of changes in groups' mice serum ALT，AST，STB，of TP index and the morphological changes of mice liver；Using the immunohistochemical image method to detect the expression of cox-2. Results Compared with the blank group，the liver tissue of model group had infl ammatory pathological change，the liver index decreased signifi cantly，and there were signifi cant elevated in serum ALT，AST，STB，while TP content decreased signifi cantly；Compared with model group，ALT，AST，STB content in mice serum of Penthorum group，Penthorum with Scutellariae 1：1group，1∶2 group and 1∶3 group decreased significantly；in the study of TP，the content of Penthorum group，Penthorum with Scutellariae 1∶1 group，1∶2 group increased signifi cantly. The research of expression of COX-2 showed that，the expression of blank group had only a small amount of positive result；Compared with the blank group，the expression of COX-2 in liver tissue of model group was signifi cantly enhanced；Compared with model group，the expression of COX-2 in treatment group were signifi cantly lower，and the expression of Penthorum with Scutellariae 1∶2 group was the weakest. Conclusion Penthorum can signifi cantly improve the symptoms of hepatitis in mice，Scutellariae has a tendency to improve its infl ammatory symptoms，when both two compatible used，especially scutellaria 2 times than Penthorum，could signifi cantly relieve the symptoms. During the clinical medication，dosage of Scutellariae twice than Penthorum could be better.

Penthorum Scutellariae Compatibility Viral hepatitis

310053 浙江中医药大学（翁金月）325000 浙江省温州市中医院（樊建霜）325000 温州医科大学附属第一医院（王蓉蓉）325000 浙江省温州市新特医药有限公司（俞志敏）