方 芳， 李相前， 赵玉萍， 孔 晶， 朱 春

（淮阴工学院生命科学与化学工程学院，江苏淮安 223003）

纤维素是植物经光合作用合成的一种由许多葡萄糖基组成的大分子物质，由于其结构组成复杂，而不利于纤维素的转化利用（李忠玲，2011）。纤维素酶的水解作用是一种高效、彻底、无污染分解纤维素的理想途径（侯丽丽，2010）。能产生纤维素酶的微生物有细菌及青霉、曲霉、木霉等真菌，其中木霉是纤维素酶的重要生产菌株，而Trichoderma asperelloides是从棘孢木霉中分出的新种，两者形态学基本无区别，但分子序列标记不同（Smith等，2013）。目前国内尚未见该菌种产纤维素酶的文献报道。Trichoderma asperelloides41245能较好地以秸秆、麸皮、豆渣等为底物生产纤维素酶，为了进一步提高该菌株的产酶能力，本研究选用了紫外-微波复合处理对该菌株进行诱变，并通过纤维素刚果红平板初筛和固态发酵产酶复筛试验，选育产酶活力较高的突变菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 菌种为Trichoderma asperelloides，购于CICC，编号为41245。

1.1.2 培养基 菌种保藏和活化培养基：6°Bé麦芽汁100 mL，纤维素粉2 g，琼脂2 g。初筛培养基：羧甲基纤维素钠（CMC）10 g，蛋白胨2 g，磷酸二氢钾 1 g，硫酸镁0.5 g，酵母膏0.5 g，刚果红 0.0334 g，琼脂18.00 g，水1000 mL。固态发酵复筛培养基：在250 mL三角瓶中加入麦秸3 g，麸皮2 g，1%硫酸铵11.25 mL，121℃灭菌 20 min，备用。

1.2 方法

1.2.1 菌种的活化 将Trichoderma asperelloides接种到麦芽汁培养基平板上，28℃培养5～7 d。

1.2.2 孢子悬浮液的制备 将活化好的菌株用无菌水洗涤孢子，置于含玻璃珠的三角瓶中，在28℃、120 r/min摇床振荡20 min，用4层灭菌擦镜纸过滤振荡液，在显微镜下用血球计数板对滤液中孢子进行计数，调整其浓度至106个/mL，保存在4℃冰箱备用。

1.2.3 菌种的诱变 紫外诱变：打开紫外线灯（18 W）预热30 min，取5份制备好的5 mL孢子悬液于9 cm培养皿中，将其置于距离紫外灯24 cm（垂直距离）处的磁力搅拌器上照射1 min后，打开皿盖，边搅拌边紫外诱变处理，分别照射2、4、6、8、10 min，诱变菌液在黑暗中4℃冷藏1.5 h后在红灯下稀释适当倍数，取0.1 mL涂布于麦芽汁培养基平板28℃避光培养2～3 d，计平板菌落数。根据对照平板上的菌落数，计算紫外诱变不同时间的致死率，绘制致死曲线（Qu等，2011）。

微波诱变：选取经紫外诱变后产纤维素酶最高的突变株为出发菌株，选用功率700 W、额定微波频率2450 MHz的微波炉，按不同的辐照时间10、30、60、90、120 s， 对孢子悬浮液进行辐照处理，每辐射10 s用冰水混合浴法消除微波热效应。然后稀释适当倍数，取0.1 mL孢子悬液涂布于麦芽汁培养基平板，28℃培养2～3 d后进行菌落计数。根据对照平板上的菌落数，计算微波不同辐照时间的致死率，绘制致死曲线（贺小贤等，2011；兰时乐等，2007）。

紫外和微波诱变的致死率公式为：

1.2.4 菌株的初筛 选择致死率在70%～80%平板上的单菌落分别点种于纤维素刚果红初筛培养基上，每个平板点3个点，于28℃培养96 h，挑选出Hc值 （单菌落的纤维素水解圈与菌落直径之比）大于对照组的菌种，接种于麦芽汁斜面培养基上，备用。

1.2.5 固态发酵产酶复筛 将对照菌株与初筛所得的菌株分别配制成菌浓度为106个/mL的孢子悬浮液，以10%的接种量接种于固态发酵复筛培养基中，混匀，于28℃恒温培养96 h，测定纤维素酶活力。

纤维素酶粗酶液的制备：将发酵后的固态培养基按照固液比为1∶10，置于30℃的120 r/min摇床浸提1 h，然后在4℃，3000 r/min离心 l5 min，上清液即为粗酶液。

纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，包括内切葡聚糖酶、外葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。滤纸是聚合度和结晶度都居“中等”的纤维性材料。滤纸酶法是以滤纸为底物经纤维素酶水解后生成还原糖的量来表征纤维素酶系总的糖化能力的方法，此方法应用广泛，它反映了三类酶组分的协同作用，统称滤纸酶活（FPA）（赵玉萍和杨娟，2006）。因此本试验用FPA代表纤维素酶活力。其测定方法为：在试管中加2 mL 0.1 mol/L、pH 4.6醋酸缓冲液，再加入1条1 cm×6 cm滤纸（50 mg±1 mg），50 ℃预热 5 min 后在试管中加入0.5 mL适当稀释的酶液，50℃保温 60 min，加入25 mL容量瓶中 （事先容量瓶中加入2 mL 3，5-二硝基水杨酸试剂），在沸水浴5 min，流水冷却至室温，用蒸馏水定容至刻度。同时用失活的酶作对照。在540 nm下测吸光度值，并从葡萄糖标准曲线查出相应的葡萄糖含量，折算成酶单位。葡萄糖标准曲线参照王菁莎等（2005）绘制。

本试验中酶活单位定义为以滤纸为底物，在pH 4.6、50℃，恒温 60 min条件下，以水解反应中每分钟催化底物水解形成1 μmol葡萄糖的酶量为一个单位（U）。

1.2.6 遗传稳定性 将最终筛选得到的突变菌株在麦芽汁培养基斜面连续传代5次，每转接1次，同时接入固体发酵培养基进行培养产酶试验，测定其FPA。

1.2.7 发酵过程中突变和对照菌株产纤维素酶的变化研究 将原始菌株和诱变获得的高产纤维素酶的菌株分别配制成菌浓度为106个/mL的孢子悬浮液，以10%的接种量接种于固态发酵复筛培养基中，混匀，于28℃恒温培养144 h，每隔24 h测定一次FPA。

2 结果与分析

2.1 紫外诱变 从图1可以看出，Trichoderma asperelloides41245孢子液经紫外线照射后，在4 min内随着诱变时间的增加，致死率迅速上升。在4 min时致死率为78%，之后随着时间的延长，致死率增加缓慢，在10 min时致死率已达到100%。贺小贤等（2011）、胡婷婷和邱雁临（2008）研究表明，致死率在70%～80%的诱变剂量，正突变率较高。因此，确定紫外最佳诱变时长为4 min。本试验选择4 min作为诱变剂量进行反复诱变，将其平板上的单菌落分别点种于初筛培养基上，筛选Hc值较原始菌株大的菌株进行复筛。纤维素水解圈的大小与纤维素酶活存在一定正相关性，因此选择水解圈相对较大，即Hc值大的菌株为初筛菌株。本试验诱变筛选到8株Hc值较原始菌株大的菌株，分别编号为 ZW1、ZW2、ZW3、ZW4、ZW5、ZW6、ZW7、ZW8，其 Hc值见表 1。但梅炼等（2013）研究表明，Hc较大的菌落与其发酵酶活的正相关也不是完全绝对的，所以必须对初筛的菌株进行固态发酵复筛。从表1结果来看，也验证了这一点，如ZW4和ZW6两者Hc值相同，但发酵酶活存在差别；ZW7还出现了比原始菌株低的FPA。原因可能是平板厚薄不均、透明圈测定法不够精确、突变株性状不稳定等（兰时乐，2007）。从表1中的FPA及其变化率（相比于原始菌株）来看，ZW8的FPA最高，比原始菌株提高了28.09%，所以选取ZW8菌株作为下一轮诱变的出发菌株。

图1 Trichoderma asperelloides41245菌株紫外诱变的致死率

表1 紫外诱变所得菌株的初筛和复筛结果

2.2 微波诱变 以紫外诱变获得的ZW8菌株作为出发菌株，利用微波辐照，致死率与辐照时间的关系如图2所示。随着诱变时间的增加，致死率逐渐增大，在120 s时致死率达到100%，由此可见Trichoderma asperelloides菌株对微波辐照比较敏感。与紫外诱变一样，选取致死率在70%～80%的诱变时间为最佳诱变时间，因此选取诱变60 s时（致死率为76%）平板上的菌株进行后续的初筛。通过纤维素刚果红平板初筛，筛选到4株Hc值较ZW8大的菌株，分别编号为ZWWB1、ZWWB2、ZWWB3、ZWWB4，并对这 4 株菌进行固态产酶发酵试验，结果见表2。通过微波诱变获得的这4株菌其FPA与ZW8相比，均有不同程度的提高，其中ZWWB1较ZW8提高幅度大，达到41.33%。

图2 Trichoderma asperelloides ZW8菌株微波诱变的致死率

表2 微波诱变所得菌株的初筛和复筛结果

2.3 遗传稳定性试验 部分经人工诱变处理得到的高产突变菌株遗传基因型不稳定，易出现回复突变或产量下降等问题，故需要验证其遗传稳定性，一般连续传代多次后产量不下降或下降不明显的菌株遗传稳定性较好，适合用于以后的生产实践。 对筛选得到的 ZWWB1菌株进行遗传稳定性试验，5次传代测得的FPA结果见表3。从表3可以看出，经5次传代接种培养后，突变菌株的FPA变化不大。且从肉眼观察菌体生长情况、孢子大小、颜色等也均无变化。由此得出，Trichoderma asperelloidesZWWB1菌株遗传性能稳定，可以作为进一步开发高活力纤维素酶的菌种。

表3 突变菌株ZWWB1遗传稳定性U/g

2.4 发酵过程中突变菌株和原始菌株的纤维素酶活性变化 将突变菌株和原始菌株接种于固态发酵培养基中，每隔24 h定时取样测定FPA，直到144 h发酵过程结束，结果如图3所示。由图3可见，突变菌株酶活明显高于原始菌株，在发酵96 h时，突变菌株FPA是原始菌株的1.81倍。另外突变菌株与原始菌株的酶活变化趋势基本相同，即在接种后的最初24 h，为菌株生长的适应期，接入的孢子开始萌发，此时产酶活力低，产酶量也比较少，培养时间在24～96 h时，FPA迅速升高，这是主要的产酶阶段，但在96 h以后，FPA开始缓慢下降。因此，最佳的发酵产酶时间是96 h。

图3 培养时间对突变菌株与原始菌株产酶的影响

3 讨论与结论

紫外诱变是一种传统的诱变方法，具有方法简单、效果显著的优点，有报道表明紫外线与其他诱变剂进行复合处理，可使紫外线的诱变效果得到提高（王智慧等，2013；曾庆梅等，2010）。 微波诱变是一种较新的诱变方法，它不需昂贵的设备、育种效果好、操作简单、安全、易推广。因此本试验利用这两种物理方法复合诱变，获得一株产纤维素酶较高的菌株ZWWB1，在以麦秸和麸皮为基质的固态发酵培养基培养96 h，FPA达15.08 U/g，是原始菌株的1.81倍。传5代FPA变化不大，说明该菌株遗传性能稳定。今后可进一步优化该菌的固态发酵产酶条件，或考虑利用基因工程手段改造以期进一步提高其产酶能力，使其在秸秆饲料发酵和纤维素酶生产中发挥更大的作用。

[1]贺小贤，赵会芳，孙福林，等.微波结合盐酸羟铵诱变选育高产醋酸菌[J].中国酿造，2011，12：74 ～ 76.

[2]侯丽丽，车程川，杨革.不同预处理方法对秸秆固态发酵产纤维素酶的影响[J].曲阜师范大学学报，2010，36（1）：100 ～ 103.

[3]胡婷婷，邱雁临.原生质体紫外诱变选育纤维素酶高产菌株[J].化学与生物工程，2008，25（8）：58 ～ 60.

[4]兰时乐，李立恒，王晶，等.微波诱变结合化学诱变选育纤维素酶高产菌的研究[J].微生物学杂志，2007，27（1）：22 ～ 25.

[5]李忠玲，秦涛，岳淑宁，等.绿色木霉产纤维素酶菌种诱变[J].中国酿造，2011，12：65 ～ 67.

[6]梅炼，张爱萍，徐晓立，等.绿色木霉的选育及固态发酵产纤维素酶的研究[J].可再生能源，2013，31（11）：94 ～ 100.

[7]王菁莎，王颉，刘景彬.康宁木霉固态发酵秸秆生产纤维素酶的研究[J].纤维素科学与技术，2005，13（4）：26 ～ 31.

[8]王智慧，杨帅，刘宏民.氯化锂-紫外-微波复合诱变红霉素高产菌株的研究[J].郑州大 学学报（理学版），2013，45（4）：88 ～ 90.

[9]曾庆梅，李志强，司文攻，等.紫外-微波复合诱变选育高产酿酒酵母菌株[J].微波学报，2010，8：329 ～ 332.

[10]赵玉萍，杨娟.四种纤维素酶酶活测定方法的比较[J].食品研究与开发，2006，27（3）：116 ～ 118.

[11]Qu ER-J，Xie Z，Ma M X.Screening for a novel Trichoderma vride strain highly producing cellulase via ultraviolet mutagenesis[J].Agricultural Science ＆ Technology，2011，12（10）：1411 ～ 1412.

[12]Smith A，Beltra?N C A.，Kusunoki M，et al.Diversity of soil-dwelling Trichoderma in Colombia and their potential as biocontrol agents against the phytopathogenic fungus Sclerotinia sclerotiorum （Lib.）de Bary[J].J Gen Plant Pathol，2013，79：74 ～ 85.■