陈亚妮， 高俊杰， 朱文叶， 陈铁军， 沈智杰， 王肖龙

（上海中医药大学附属曙光医院心血管科，上海　201203）

［药 理］

速效救心丸干预心肌缺血/再灌注大鼠线粒体通透性转换孔及心肌细胞凋亡

陈亚妮， 高俊杰， 朱文叶， 陈铁军， 沈智杰， 王肖龙*

（上海中医药大学附属曙光医院心血管科，上海201203）

目的 观察速效救心丸（川芎、冰片）对心肌缺血/再灌注大鼠线粒体通透性转换孔及心肌细胞凋亡的影响。方法 将55只SPF级Wistar大鼠随机分为空白组，模型组，速效救心丸低、中、高剂量组（每组11只）。药物组给予对应剂量的速效救心丸混悬液灌胃，空白组与模型组给予同等容积的双蒸水灌胃，连续灌胃7 d结束后结扎左冠状动脉前降支建立心肌缺血/再灌注大鼠模型。观察速效救心丸干预后心肌线粒体通透性转换孔（MPTP）、细胞色素C的表达情况，并采用TUNEL检测心肌细胞凋亡，HE染色观察大鼠心肌细胞形态。结果 与空白组比较，模型组MPTP开放程度增加，细胞色素C水平升高（P＜0.05），TUNEL的阳性反应面积率显著上升（P＜0.01）。速效救心丸高、中、低剂量组的TUNEL阳性反应面积率等较模型组降低（P＜0.01），但药物组间比较无统计学差异。速效救心丸高剂量组的MPTP开放程度（P＜0.05）、细胞色素C水平（P＜0.01）较模型组降低。结论 速效救心丸对大鼠心肌缺血/再灌注损伤具有一定的保护作用，其机制可能与抑制MPTP的开放有关。

速效救心丸；线粒体通透性转换孔；细胞凋亡；细胞色素C

近年来，急性心肌梗死在我国的发病率有明显增高的趋势。心梗面积的大小对于心梗病人的死亡率起着决定性的作用。目前最有效的办法是在心梗发作后越短的时间内进行溶栓或者介入手术。虽然，再灌注的益处不可否认，但是其副作用也不可忽视，包括心肌顿挫、室性心律失常和不可逆的心肌再灌注损伤等，其损伤甚至可能抵消一部分心肌再灌注的好处。越来越多的证据表明，不可逆的心肌再灌注损伤的机制可能与线粒体通透性转换孔（MPTP）的开放有关，该非特异性通道的开放，使线粒体膜电位崩溃，呼吸链断裂，ATP合成分解失衡，细胞色素C和其他促凋亡因子释放［1-4］。Argaud等［5］发现在离体大鼠心脏中，缺血期，MPTP关闭，但是再灌注时，MPTP开放。由于线粒体通透性转换孔的开放在心肌再灌注损伤所导致的心肌坏死中是一个非常重要的过程，因此也为心肌细胞的保护提供了可能的靶点。

速效救心丸的临床疗效确切，本课题组发现速效救心丸可降低急性冠脉综合征患者冠状动脉介入（PCI）术后的CK、CK-MB、TnI水平［6］。本实验通过对缺血/再灌注大鼠的速效救心丸预处理，从线粒体的角度探讨速效救心丸对缺血/再灌注损伤的保护机制。

1　实验材料

1.1实验动物 SPF级别健康成年Wistar雄性大鼠55只，体质量180～200 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号2007000562281。所有大鼠分笼饲养于上海中医药大学实验动物中心。

1.2实验药物 速效救心丸，由天津中新药业集团股份有限公司第六中药厂生产（批号618034）。将速效救心丸碾磨成细粉，溶解于双蒸水，制备成质量浓度为32 g/L、64 g/L和128 g/L的混悬液。

1.3主要试剂 大鼠细胞色素C ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所）；纯化线粒体膜通道（MPTP）比色法检测试剂盒（上海一基实业有限公司）；DeadEndTMColorimetric TUNEL System（由Promega提供，LOT：0000086338）。

1.4主要仪器 Labsystems Multiskan MS Microplate Reader型酶标仪（芬兰制造）；微量恒温器（绍兴市卫星医疗设备制造有限公司）；转移脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；光学显微镜、荧光过滤器（Olympus）；实验动物心电图仪（日本光电公司生产）。

2　实验方法

2.1实验动物分组 将55只体质量180 g左右的雄性Wistar大鼠随机分为以下5组：空白组（11只）、模型组（11只）、速效救心丸高剂量组（11只）、速效救心丸中剂量组（11只）、速效救心丸低剂量组（11只）。在造模过程中，因气道管理不当，引起速效救心丸中剂量组死亡大鼠2只。故本课题分组情况为：空白组11只，模型组11只，速效救心丸高剂量组11只、速效救心丸中剂量组9只、速效救心丸低剂量组11只。每组各取3只大鼠石蜡切片。

2.2分组给药 造模前，根据“人和动物按体表面积折算的等效剂量比值表”折算，速效救心丸高剂量为人常规剂量的两倍，速效救心丸中剂量为人常规剂量，速效救心丸低剂量为人常规剂量的一半。药物组按高、中、低剂量分别给予速效救心丸混悬剂1.28、0.64、0.32 g/kg灌胃，每日1次。空白组和模型组给予等量双蒸水每日1次，定时灌胃。疗程为一周。

2.3动物模型制备 参照文献［7-8］，将方法略加改良，将大鼠称定质量麻醉固定，暴露气管，完成插管，呼吸机辅助呼吸，感受心尖搏动处，切开皮肤，钝性分离胸部肌肉，打开胸腔，剪开心包，暴露心脏，在心脏表面动脉圆锥与左心耳交界稍下用无创伤缝线穿线结扎左冠状动脉前降支，结扎部位塞入大小厚度合适的棉条，以防止损伤冠脉，结扎部位以下心肌变白，活动减弱，心电图提示ST段抬高为缺血成功。结扎后30 min，打开缝线使血流再通30 min，测心电图，ST段下降二分之一，发白部分心肌颜色变红，为再通成功。取出心脏，于生理盐水中洗去血污，去除左心室以外组织。

2.4观测指标与检测方法

2.4.1纯化线粒体膜通道（MPTP）开放程度的测定 心肌线粒体提取成功后，立即用分光光度法检测MPTP开放程度。步骤参照纯化线粒体膜通道（MPTP）比色法检测试剂盒。

2.4.2心肌组织细胞色素C水平的测定 采用大鼠细胞色素C（Cytochrome C，Cyt-C）ELISA试剂盒。

2.4.3HE染色 取部分心肌组织石蜡包埋、切片，HE染色观察大鼠心肌形态变化。

2.4.4心肌细胞凋亡的测定 取部分心肌组织石蜡包埋、切片，具体步骤参照试剂盒。图像分析采用Image-Pro软件，每张片子在凋亡阳性区域随机选取3个视野，计算每个视野内棕黄色染色区域的反应面积为阳性面积，取每组均值进行比较。

3　统计分析

4　结果

4.1速效救心丸对心肌组织MPTP的影响 使用CaCl2诱导MPTP的开放，引起A440处线粒体吸光度的降低。如图1A所示：与空白组相比，模型组CaCl2诱导MPTP开放，线粒体肿胀，吸光度比值（A440/初始A440）随着时间下降迅速；与模型组相比，速效救心丸高、中、低剂量组的心肌线粒体的吸光度比值下降缓慢；图1B示30 min时吸光度的下降幅度（ΔA440），与空白组相比，模型组下降幅度较大，并与空白组存在统计学差异（P＜0.05）；与模型组相比，速效救心丸低、中、高剂量组下降幅度较低，但高剂量组与模型组之间存在统计学差异（P＜0.05）。

4.2速效救心丸对各组大鼠胞浆内细胞色素C表达的影响 与空白组相比，模型组Cyt-C的表达增加（P＜0.05）；与模型组相比，速效救心丸低、中剂量组Cyt-C的表达均有降低的趋势，但无统计学差异（P＞0.05）。与模型组相比，速效救心丸高剂量组Cyt-C的表达明显降低（P＜0.01）。见表1。

4.3TUNEL法检测细胞凋亡结果 空白组光镜下可见少量凋亡阳性细胞，组织排列整齐严密。模型组可见细胞核固缩，核染色质边集等凋亡特征，组织排列紊乱，凋亡阳性细胞多。与空白组对比，模型组与药物组的阳性反应面积率升高（P＜0.01）。与模型组相比，药物组的阳性反应面积率降低（P＜0.01）。速效救心丸低剂量组、中剂量组与速效高剂量组之间的阳性反应面积率无差异（P＞0.05），见表2。

图1　速效救心丸对线粒体通透性转换孔的影响Fig.1 Effect of Suxiao Jiuxin Pills on CaCl2-induced MPTP opening

表1　各组细胞色素C表达水平比较（±s，μg/g）Tab.1 Expression of Cyt-C in each group（±s，μg/g）

表1　各组细胞色素C表达水平比较（±s，μg/g）Tab.1 Expression of Cyt-C in each group（±s，μg/g）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，##P＜0.01

组别剂量/（g·kg-1）动物数细胞色素C表达量空白组8 391.38±47.90模型组8 471.66±43.69*速效救心丸低剂量0.32 8 422.57±76.17速效救心丸中剂量0.64 6 413.32±38.53速效救心丸高剂量1.28 8 348.42±43.41##

表2　各组心肌组织细胞凋亡TUNEL阳性面积率比较（±s）Tab.2 Apoptosis rate for each group as determ ined by TUNEL method（±s）

表2　各组心肌组织细胞凋亡TUNEL阳性面积率比较（±s）Tab.2 Apoptosis rate for each group as determ ined by TUNEL method（±s）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

组别剂量/（g·kg-1）动物数阳性反应面积率空白组—3 0.98±0.34模型组—3 6.09±0.62**速效救心丸低剂量组0.32 3 3.34±0.20##**速效救心丸中剂量组0.64 3 3.46+0.21##**速效救心丸高剂量组1.28 3 3.26+0.37##**

4.4HE染色结果 通过HE染色进一步观察心肌细胞的形态及炎性细胞浸润的情况。空白组可见正常心肌细胞无水肿、肥大、变形和坏死，心肌纤维排列整齐清晰，细胞核无固缩，细胞膜完整。与空白组相比，模型组大鼠心肌纤维组织紊乱，部分溶解断裂，间质内见水肿变性，细胞膜被破坏，细胞核固缩，细胞染色不均匀。速效救心丸低剂量组与模型组无太大差异。速效救心丸中剂量组及速效救心丸高剂量组心肌纤维断裂溶解，间质内水肿情况较模型组减轻。见图2。

图2　各组心肌HE染色（×100）Fig.2 Morphological changes（HE staining×100）

5　讨论

缺血性心脏病已成为全世界最主要的死亡原因之一。冠脉血运重建可以减少心肌的坏死面积，改善心功能，但是在血运重建的同时，常常伴有再灌注引起的心肌细胞进一步的坏死，心肌梗死面积增加，称为心肌缺血/再灌注损伤（MIRI）。

速效救心丸由川芎、冰片等药物组成。川芎辛温，归肝胆心包经，《神农本草经》记载川芎能“主中风入脑头痛、寒痹，筋脉缓急”，为临床治疗心脉瘀阻之胸痹心痛之要药。冰片辛苦微寒，归心脾肺经，《医林纂要》记载冰片“性走而不守”，具有开窍醒神，通窍止痛的功效。临床有实验证明大剂量的速效救心丸能降低急诊PTCA术后心律失常的发生率，尤其能减少再灌注后快速室性心律失常，降低恶性心律失常的致死率［9］，但具体机制不详。

一些研究证实线粒体通透性与缺血/再灌注损伤相关［5，10-12］。线粒体通透性转换现象主要是指位于线粒体内膜的转换孔开放，以及随之而来的离子平衡被打破，基质水肿和外膜破裂，激活相关的凋亡因子，从而介导细胞死亡。在缺血/再灌注、心肌梗死后、心肌重组和心衰等病理状态下，细胞内钙离子超载，氧化应激和ATP合成减少都可引起线粒体渗透性转换孔的开放。根据外界刺激的严重程度，决定了MPTP的开放程度，进一步决定了细胞的死亡方式——坏死或者凋亡［13］。当外界刺激较重，线粒体上的MPTP持续性的不可逆的开放，线粒体去极化，大量离子涌入，基质水肿，外膜破裂，凋亡因子释放，ATP耗竭，这种灾难性的MPTP的开放将使细胞不可避免大量坏死。当外界刺激较轻时，一部分线粒体上的MPTP一过性的开放，线粒体去极化，基质水肿，凋亡因子释放，ATP仍可由部分未受损的线粒体提供，但是这并不意味着细胞能避免死亡，线粒体还通过凋亡来介导细胞死亡。

在本实验中，速效救心丸预处理的缺血再灌注大鼠心肌细胞相比模型组而言，线粒体通透性转换孔（MPTP）的开放程度受到抑制，细胞色素C的表达水平下降，细胞凋亡水平降低。速效救心丸的低、中剂量组可以抑制MPTP开放，减少细胞色素C的表达，与模型组相比无统计学差异，而高剂量组与模型组相比存在统计学差异（P＜0.05和P＜0.01）。而速效救心丸高、中、低剂量组在细胞凋亡程度上无剂量依赖性。本实验研究结果表明，速效救心丸通过抑制MPTP的开放，保护线粒体膜功能的完整性，减少细胞色素C的释放，以达到降低缺血/再灌注后细胞凋亡程度，实现对心肌细胞的保护作用。

本实验深入了解速效救心丸的心肌保护机制，为中医药临床干预心肌缺血/再灌注损伤，提供一定的客观依据。

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Suxiao Jiuxin Pills interfere MPTP and m yocardial cell apoptosis in rats with ischem ia-reperfusion injury

CHEN Ya-ni， GAO Jun-jie， ZHUWen-ye， CHEN Tie-jun， SHEN Zhi-jie， WANG Xiao-long*
（Cardioυascular Department of Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai Uniυersity of Traditional Chinese Medicine，Shanghai201203，China）

AIM To explore the interfering effectof Suxiao Jiuxin Pills（Chuanxiong Rhizoma，Borneolum syntheticum）on opening ofmitochondrial permeability transition pore（MPTP）andmyocardial cell apoptosis in ratswith ischemia-reperfusion injury.METHODS Fifty-five SPF level healthy male Wistar rats were randomly divided into five groups（eleven in each），the control group，the model group，the Suxiao Jiuxin Pills low，middle and high dosage groups（receiving Suxiao Jiuxin Pills）.The controlgroup and themodelgroup were treated with purewater.The leftanterior descending branches of ratswere ligatured to cause the ischemia-reperfusionmodel after seven-day treatment.The opening of mitochondrial permeability transition pore and the expression of cytochrome C（Cyt-C）were examined. TUNELmethod was used for cell apoptosis.HE staining for the observation ofmyocardial cellmorphology was carried out.RESULTS Compared with the control group，MPTP opening，Cyt-C and the rate of positive reactive area of TUNEL inmodel group were significantly higher（P＜0.05，P＜0.05，and P＜0.01，respectively）.The ratesof positive reactive area of TUNEL in Suxiao Jiuxin Pills groups（low，middle and high）were markedly lower than those in the model group（P＜0.01）without significant difference among groups.Moreover，the sizes of MPTP opening（P＜0.05）and the expression of Cyt-C（P＜0.01）in Suxiao Jiuxin Pills high dosage group were all lower than those of themodelgroup.CONCLUSION Suxiao Jiuxin Pills have certain protective effect in the treatment of myocardial ischemiareperfusion injury in rats and itsmechanism might be related to inhibitory effect of the MPTP opening.

Suxiao Jiuxin Pills；mitochondrial permeability transition pore（MPTP）；cell apoptosis；cytochrome C

R285.5

A

1001-1528（2015）03-0469-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.001

2014-11-05

上海市卫生局科研基金项目（20114049）；上海市科委立项课题（12401903400）；上海市中医临床重点实验室（14DZ2273200）；上海市中医发展办公室中西医结合重点病种项目（ZXbz2012-08）

陈亚妮（1989—），女，硕士生，主要从事中西医结合心血管病研究。Tel：13788985868，E-mail：458571422@qq.com

王肖龙（1965—），男，主任医师，教授，硕士生导师，主要从事中西医结合心血管病的防治研究。Tel：13501991450，E-mail：wxlqy0214@163.com