程立子+吴日然+于文娟+等

[摘要] 目的 探讨体外培养1 d对玻璃化解冻卵裂期胚胎移植效果的影响。 方法 选择本中心2012年1～7月进行玻璃化冷冻并复苏的277周期卵裂期胚胎作为研究对象，根据解冻后是否多培养1 d分为对照组和实验组。对照组在解冻当天移植，共123周期。实验组解冻后多培养1 d，共154周期。实验组又分为培养后含桑葚胚组（A组）及无桑葚胚组（B组）。观察延长体外培养时间对妊娠结局的影响以及培养后胚胎发育情况与妊娠结局的关系。 结果 实验组的妊娠率和着床率显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。A组的妊娠率与着床率显著高于B组，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 体外培养1 d不影响玻璃化解冻后卵裂期胚胎的移植效果，延长培养时间有利于选择发育良好的胚胎并显著提高临床妊娠率和着床率。

[关键词] 体外培养；玻璃化解冻；卵裂期胚胎；桑葚胚

[中图分类号] R321 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）09（c）-0045-04

Influence of one-day culture in vitro on embryo transplantation effect of vitrification-unfreezing at cleavage stage

CHENG Li-zi WU Ri-ran YU Wen-juan XU Jian-ya LIAO Yue-chan DU Jing

Reproductive Cente，Boai Hospital of Zhongshan City Affiliated to Southern Medical University，Zhongshan 528403，China

[Abstract] Objective To explore the influence of one-day culture in vitro on embryo transplantation effect of vitrification-unfreezing at cleavage stage. Methods 277 cycles of cleavage stage embryos on revived transplantation of vitrification-unfreezing at cleavage stage from January 2012 to July in our center were selected and divided into the control group （123 cycles） and the experimental group （154 cycles） according to whether one-day more culture after unfreezing.The control group was transplantated during the same day after unfreezing，the experimental group was transplantated one-day more culture after unfreezing.The experimental group was again divided into morula group （group A） and non-morula group （group B） after cultivation.Influences on extended culture in vitro on pregnancy outcome and relationships between embryonic development after cultivation and pregnancy outcome were observed. Results The pregnancy rate and the rate of embryonic implantation in the experimental group was higher than that in the control group，with significant difference（P<0.05）.The pregnancy rate and the rate of embryonic implantation in group A was higher than that in group B，with significant difference（P<0.05）. Conclusion One-day more culture in vitro does not affect on embryo transplantation of vitrification-unfreezing at cleavage stage.Extension of culture period is beneficial to select well-developed embryo and also remarkably improves clinical pregnancy rate and rate of embryonic implantation.

[Key words] Culture in vitro；Vitrification-unfreezing；Cleavage-stage embryo；Morula

胚胎冷冻保存技术在辅助生殖技术中占有重要地位。研究显示，玻璃化冷冻复苏后的胚胎代谢和细胞分裂的速度比程序冷冻解冻后的胚胎更快[1]。这项技术大大提高了体外授精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）的累积妊娠率，有利于预防严重的卵巢过度刺激综合征（ovarian hyper-stimulation syndrome，OHSS），在为患者减少经济负担的同时也增加了患者受孕的概率。本研究选取玻璃化解冻后在体外培养1 d的胚胎作为研究对象，观察其发育情况，旨在探讨延长体外培养时间对妊娠结局的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择本中心2012年1～7月进行玻璃化冷冻并复苏的卵裂期胚胎作为研究对象，共277周期，冷冻胚胎均为第3天卵裂期胚胎。根据复苏后移植时间的不同分为对照组（当天移植组）和实验组（体外培养1 d后移植组）。对照组共123周期，平均年龄为（31.03±4.10）岁。实验组共154周期，平均年龄为（31.26±3.81）岁。所有患者均按本中心常规方法进行促排卵、取卵、体外受精及培养。所有胚胎均于第3天进行玻璃化冷冻。实验组根据胚胎发育后是否含有桑椹胚分为A组（含桑葚胚）和B组（不含桑葚胚），桑葚胚指含有12～16个卵裂球的胚胎。

1.2 方法

1.2.1 冷冻胚胎选择 根据胚胎形态学标准于第3天对胚胎进行分级，正常受精且第3天卵裂球数≥4个并且碎片≤20%的Ⅰ、Ⅱ级胚胎为可利用胚胎。经患者同意，将移植后剩余的可利用胚胎冷冻或者将所有可利用胚胎冷冻。

1.2.2 胚胎冷冻解冻方法 玻璃化冷冻液（Vitrolife？誖，RapidVitTM Cleave，3×10 ml，REF 10117）及解冻液（Vitrolife？誖，RapidWarmTM Cleave，4×10 ml，REF 10118）由广州尊博医疗器械有限公司提供。①玻璃化冷冻方法：按照Vitrolife？誖公司RapidVitTM Cleave试剂说明书要求，将试剂从冰箱内取出后预热至37℃，将1～3个胚胎放入Vitri 1TM Cleave液中平衡5～10 min，然后放入Vitri 2TM Cleave液中2 min，可看到胚胎先皱缩后恢复原状，然后将胚胎转移入Vitri 3TM Cleave液中约30 s，吹打2～3次后将胚胎放到冷冻载体（自制）上，立即投入液氮中。整个过程均在37℃条件下进行。②玻璃化解冻方法：按照Vitrolife？誖公司RapidWarmTM Cleave试剂说明书要求，将试剂从冰箱内取出后预热至37℃，将装有胚胎的载体从液氮中取出，迅速放入复苏液Warm 1TM Cleave中，10～30 s后将胚胎依次转移至Warm 2TM Cleave 1 min、Warm 3TM Cleave 2 min，Warm 4TM Cleave 5 min，最后转入囊胚培养液Vitrolife？誖 G-2 plus中，置于37℃、6%CO2培养箱内继续培养。

1.2.3 胚胎复苏成功标准 解冻后存活卵裂球数≥50%。

1.2.4 患者的准备 ①自然周期：月经规律、排卵正常患者采用自然周期，利用阴道超声技术监测卵泡及内膜发育情况，当优势卵泡直径≥16 mm、子宫内膜厚度≥8 mm时检测是否出现黄体生成素（LH）峰，LH峰后36 h左右排卵，排卵日开始肌注黄体酮20～60 mg/d，排卵后第3天解冻胚胎。②激素替代周期：月经不规则、排卵障碍、子宫内膜生长不良等患者采用激素替代周期。于月经第3天起用递增法口服戊酸雌二醇（补佳乐，先灵公司），B超监测子宫内膜厚度，当内膜厚度≥8 mm时开始每日肌注黄体酮，3 d后解冻胚胎。胚胎移植在B超引导下进行。

1.3 妊娠诊断

移植2周后测定血HCG水平，阳性者为生化妊娠，35 d后行B超检查，有孕囊者则诊断为临床妊娠。

1.4 统计学处理

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以x±s表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验组与对照组胚胎复苏率、平均移植胚胎数、妊娠率与着床率的比较

实验组的妊娠率和着床率显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

2.2 A组与B组平均移植胚胎数、妊娠率与着床率的比较

A组的妊娠率与着床率显著高于B组，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。

表2 A组与B组平均移植胚胎数、妊娠率与着床率的比较

3 讨论

3.1 冻融后获得高质量的胚胎是影响冷冻胚胎移植结果的重要因素

在辅助生殖技术中，由于控制性超排卵技术的应用，90%的患者可在一次体外受精周期获得较多胚胎。本中心70%以上患者的胚胎需要进行冷冻保存。玻璃化冷冻方法稳定、高效、对胚胎的发育潜力影响最小，为预防OHSS发生起到了重要作用，甚至有人认为解冻周期移植可能会完全取代新鲜周期移植[2]，但目前冻融过程仍不完美，胚胎经过冷冻和复苏的过程后，部分卵裂球会受损伤，发生裂解凋亡或者坏死，而坏死的卵裂球也会影响其他卵裂球的发育[3]。即使是卵裂球全部存活的解冻胚胎也有可能受到肉眼无法分辨的损伤，继而降低继续分裂的能力。研究显示，胚胎冷冻虽然能保持胚胎的发育潜力，但冷冻和解冻的过程会导致胚胎减少30%的发育能力，进而导致囊胚形成率和妊娠率降低[4]。

3.2 延长体外培养时间、观察解冻后胚胎的继续发育情况对评价胚胎发育潜力的意义

关于延长体外培养时间对胚胎发育的影响，目前观点尚不统一，本研究结果与叶英辉等[4-9]的研究结果一致，提示延长胚胎复苏后的体外培养时间，相比于解冻当日移植的胚胎，其妊娠率和种植率均可明显提高，而Rato等[10]的研究显示，胚胎解冻后培养2～5 h，其种植率及活产率均高于解冻后培养24 h，相关研究结果同样显示解冻后次日移植不能提高临床妊娠率和种植率[11-13]。

延长解冻后体外培养时间，无疑会更有利于观察胚胎的发育情况。本研究结果显示，解冻后大多胚胎都能恢复应有的发育能力，但是其中部分胚胎发育速度较慢（如只增多1～3个卵裂球），这些胚胎在妊娠率、着床率方面显著低于正常发育的移植胚胎。罗金等[14]的研究显示，延长解冻后体外培养时间，可观察到无法继续生长的胚胎，这类胚胎发育潜能低，因此，可根据解冻后胚胎生长情况来选择发育潜能大的胚胎进行移植。此外，其研究显示，部分已复苏的胚胎可能受到了不可见的损伤，仅少数卵裂球恢复发育能力，这些胚胎的整体发育潜能较低下，这与本研究结果一致。

3.3 胚胎发育与子宫内膜生长是否同步对着床的影响

本研究结果显示，解冻后培养1 d后再行移植的含有发育至桑葚胚及以上的胚胎，其着床率及妊娠率显著高于移植不含桑葚胚的胚胎。冻融胚胎移植时机的选择非常重要，胚胎发育的速度与子宫内膜成熟度不一致也可能是导致种植失败的原因之一。玻璃化冷冻胚胎解冻后发育速度较快，只有提前1 d准备子宫内膜，才能更好地让两者保持一致，而冻融后选择发育潜能好的胚胎进行移植，其着床率与妊娠率均有显著提高[15-17]。

综上所述，胚胎质量是影响解冻周期移植成功的关键因素[18]，延长体外培养时间不会增加胚胎自身的发育潜能，但是可以通过此种方法来观察胚胎复苏后的生长情况，继而更好地评估其未来的发育潜力。发育潜力高的胚胎与子宫内膜成熟度的同步性越高，越有利于胚胎着床。通过多培养1 d选择出更适宜移植的胚胎，可以将发育潜力差的胚胎淘汰，保证移植周期中的胚胎质量，提高临床妊娠率和着床率。

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（收稿日期：2015-03-09 本文编辑：祁海文）