宋光均等

摘要：通过液相-光谱联用，采用向量-子空间夹角判据进行计算，建立了饮料中柠檬黄和日落黄的分析方法。该方法先采用全波长光纤光谱仪建立不同浓度柠檬黄和日落黄的标准光谱数据库，以及市售碳酸型饮料和功能型饮料的样品光谱数据，再进行液相-光谱联用，得到扣除饮料中待测组分后的本底光谱数据；运用向量-子空间夹角判据进行计算饮料中柠檬黄和日落黄的含量。试验结果表明，在3～30 μg/mL内柠檬黄和日落黄的标准工作曲线线性关系良好（R2柠檬黄=0.997 6，R2日落黄=0.999 8）；向量-子空间夹角判据计算结果与高效液相色谱法测定结果比较，相对误差小于2.5%，样本加标回收率为89.5%～109.0%，RSD为4.9%～6.1%，该方法能满足定量分析需求。

关键词：向量-子空间夹角；多波长紫外-可见光谱；高效液相色谱；柠檬黄；日落黄

中图分类号：O657.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）17-4277-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.17.044

柠檬黄和日落黄是碳酸型饮料和功能型饮料中广泛添加的人工合成色素，由于添加过量色素会对健康造成不良影响，因此建立碳酸型饮料和功能型饮料中柠檬黄和日落黄的分析方法对食品安全检测具有重要的作用。

目前柠檬黄和日落黄的分析方法有高效液相色谱法[1]、紫外分光光度法[2]、多元线性回归分光光度法[3]、荧光光谱法[4]、薄层色谱扫描法[5]、示差脉冲极谱法[6]等。柠檬黄含量测定的国家标准（GB4481.1-2010）[7]和日落黄含量测定的国家标准（GB6227.1-2010）[8]都已颁布，各个行业可根据相关国家标准进行检测，也可在这些技术的基础上进行改进。随着仪器技术和信息技术的飞跃发展，分析化学已不再是依赖物质消耗手段来获取信息，而是逐步发展成为化学信息科学。姚志湘课题组提出了采用“向量-子空间夹角”判据逐步扣减混合光谱中的待测组分光谱，判断出待测组分恰好消失的“等当点”并计算混合体系中待测组分含量的方法。该方法已经运用于化妆品中对羟基苯甲酸酯、酱油中苯甲酸钠和山梨酸钾的测定[9，10]。本研究基于稳健的“向量-子空间夹角”判据，采用液相-光谱联用技术，建立了饮料中柠檬黄和日落黄的同时分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Maya2000紫外-可见光纤光谱仪（美国海洋光学，扫描波长范围为190～1 100 nm）；LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）。柠檬黄（1934-21-0，大连美仑生物技术有限公司）；日落黄（2783-94-0，大连美仑生物技术有限公司）；乙腈（分析纯，安徽时联特种溶剂股份有限公司）；乙酸铵（分析纯，西陇化工）；饮料（市售）。

1.2 分析方法

1.2.1 标准光谱数据库的建立 分别精确称取0.149 5 g柠檬黄、0.150 3 g日落黄对照品于烧杯中，用二次蒸馏水溶解，分别转移定容至100 mL容量瓶中，得到1 495 μg/mL柠檬黄标准储备液和1 503 μg/mL日落黄标准储备液。根据多波长紫外可见光谱仪的响应范围，用二次蒸馏水依次稀释标准母液，得到一系列不同浓度的标准溶液，再分别测定一系列不同浓度的柠檬黄标准溶液，日落黄标准溶液的190～1 100 nm紫外可见光谱数据，经最小二乘回归得到多波长标准光谱数据（v）。

1.2.2 建立市售饮料样本光谱数据 取一定量的碳酸型饮料，超声20 min，然后用0.22 μm滤膜过滤。测定各饮料样品的190～1 100 nm紫外可见光谱（a）。

1.2.3 建立饮料本底光谱数据库 确定被测组分与本底组分完全分离的高效液相色谱条件，将液相与光谱联用，采集市售饮料样本经过色谱柱完全分离后的190～1 100 nm光谱数据，分别扣除功能型饮料和碳酸型饮料样品中与柠檬黄、日落黄具有相同出峰时间的光谱数据后，得到本底光谱数据（N）。

1.2.4 高效液相色谱条件 色谱柱为Agilent C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；柱温为30 ℃；可见紫外光纤光谱仪扫描波长为190～780 nm。流动相梯度∶0.01～9.00 min，乙腈∶0.04 mol/L乙酸铵水溶液=10∶90（V/V）；9.01～20.00 min，乙腈∶0.04 mol/L乙酸铵水溶液=40∶60（V/V）；20.01～35.00 min，乙腈∶水=10∶90（V/V）；35.01～60.00 min，乙腈∶水=95∶5（V/V）。

1.2.5 “向量-子空间夹角判据”数据处理方法 将上述标准光谱数据v，本底光谱数据N、以及样品光谱数据a导入计算平台，应用向量-子空间夹角判据算法算出饮料样本中待测组分的实际含量。具体步骤为：①依据定量精度设定扣减步长Δ；②在函数yi=aix+bi中带入较大的x1值，得到v1；其中，yi为在i波长下待测组分的吸光度值，ai、bi是常数，x表示柠檬黄或日落黄的浓度，v1表示在浓度为x1时待测组分的多波长吸光度值y1，v1为所有的yi值组成的矩阵；③从所述饮料样本的光谱数据a中扣除v1/Δ，扣除后的变量为da；把本底光谱数据N和变量da合并后记为对比空间M，计算对比空间M与v1夹角；④从待测饮料样本光谱数据a中逐步扣除v1后，重复步骤“3”；⑤当所述饮料样本中的待测组分完全被扣除后比对空间M和待测组分的光谱向量v1空间夹角值会出现最大值θmax，记录空间夹角最大值θmax出现时对应的扣减步数λ，通过待测组分的浓度x1和扣减步数λ，计算饮料样本中待测组分的含量Y1，用函数关系定义为：Y1=x1×λ/Δ；⑥比较Y1值与x1值的差值，该差值大于误差允许范围，则带入一个与Y1值相接近的x2进入步骤“2”中重新计算。

1.2.6 加标回收率试验 在已知浓度的两份饮料样品中分别添加一定量的柠檬黄、日落黄标准品，采用“向量-子空间夹角判据”方法测定加标回收率。

1.2.7 精密度试验 分别准备两种饮料样品各5份，采集样本190～1 100 nm的光谱数据，采用“向量-子空间夹角判据”方法计算样品中柠檬黄和日落黄含量，计算精密度。

2 结果与分析

2.1 建立标准光谱库

分别配制系列浓度（3～30 μg/mL）的柠檬黄、日落黄标准溶液，以水为空白对照，分别采集系列溶液的190～1 100 nm光谱，记入标准光谱数据。在柠檬黄标准光谱数据中取450 nm处的各个浓度吸光度进行线性拟合，得到柠檬黄在450 nm处的标准曲线y=0.026 4x+0.026 5，R2=0.999 8；在日落黄标准光谱数据中取480 nm处的各个浓度吸光度进行线性拟合，得到日落黄在480 nm处的标准曲线y=0.041 3x+0.052 4，R2=0.999 8。

2.2 建立市售饮料样本光谱库

在全波长下测定各饮料样品的光谱，构成饮料样本光谱a。

2.3 建立饮料本底光谱库

在待测组分与本底组分完全分离的高效液相色谱条件下，得到待测样本和对照品样本的高效液相色谱图。图1为待测组分对照品在450 nm处的高效液相色谱图，其中A为柠檬黄、B为日落黄，两种色素的出峰时间分别为柠檬黄4.678 min、日落黄16.299 min；图2和图3为饮料样本在450 nm处的高效液相色谱图，经分析对比，样品色谱图中A为柠檬黄、B为日落黄，其他的色谱峰为饮料样本中相对于色素的本底物质。采用液相-光谱联用采集多波长色谱数据，以柠檬黄的测定结果为例，从功能型饮料的多波长色谱图中扣除与柠檬黄具有相同保留时间的多波长色谱数据，其余数据为柠檬黄的本底光谱数据；从碳酸型饮料的多波长色谱图中扣除与柠檬黄具有相同保留时间的多波长色谱数据，其余数据为柠檬黄的本底光谱数据。

功能型饮料和碳酸型饮料的本底光谱数据N1和N2数据量巨大，直接采用N1和N2作为本底数据，计算时间长，运算较困难，影响了方法的时效性。以柠檬黄为例，选用主成分分析[11]，在标准化的饮料样本光谱中添加一定强度的白噪声蔽不均匀噪声和非线性因素的干扰，以二阶差分值序列的折点判断独立变量数目，得到体系主成分数目q。

其中功能型饮料扣除柠檬黄的本底主成分数为22，碳酸饮料扣除柠檬黄后的本底主成分数为21。应用[U，S，V]=svd（N）分别对两种饮料本底光谱数据库N1和N2进行奇异值分解降维，经分解后分别得到m阶行正交矩阵U、n阶列正交矩阵V和奇异值矩阵S，功能饮料本底取U得前22列为降维后的本底数据，碳酸饮料本底取U的前21列，分别重新记作N1、N2。同理，饮料中日落黄含量的分析按柠檬黄的数据处理方法进行本底光谱数据库的降维。

2.4 市售饮料中柠檬黄、日落黄的测定

将上述的样品光谱数据、本底光谱数据、柠檬黄和日落黄标准浓度值，以及不同浓度标准光谱数据导入计算平台，应用向量-子空间夹角判据计算饮料中柠檬黄和日落黄的含量。本研究的方法与高效液相色谱法进行比较，如表1所示。

由表1可知，采用向量-子空间夹角判据计算饮料中柠檬黄和日落黄的含量，与高效液相色谱法测定结果作对比，得到的RSD都小于2.5%，说明向量-子空间夹角判据测定方法准确可靠。

2.5 回收率试验结果

为验证该方法的准确性，在已知浓度的碳酸饮料中分别添加等体积的柠檬黄、日落黄标准溶液，在另一份已知浓度的功能饮料中添加等体积的柠檬黄标准溶液，然后采用向量-子空间夹角判据计算加标回收率，结果如表2所示。两种待测组分的样品加标回收率为89.5%～109.0%，RSD为4.9%～6.1%。表明该方法准确可信，可用于市售饮料的快速检测。

2.6 精密度试验结果

采用“向量-子空间夹角判据”计算各样品中柠檬黄和日落黄含量，试验结果如表3所示。由表3可知，精密度小于0.35%，说明方法的精密度良好。

3 小结与讨论

本研究通过采用液相-紫外可见光谱联用，分别建立不含被测组分的本底光谱数据、标准光谱数据和待测样品的一维混合光谱，再通过“向量-子空间夹角”判据进行计算，可解决成分复杂的混合体系中自配本底组分建库不全的缺点，该方法对于同种样品的测定，进行一次液相分离后，无需再利用液相-光谱联用积累本底，仅通过采集样品的一维光谱，即可实现同类饮料中柠檬黄和日落黄的测定，可降低仪器使用和减小试剂消耗，方法准确性和精密度较好，方法满足定量分析要求。

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