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黄芩苷对心肌梗死大鼠心肌细胞保护作用的研究※

2015-09-17戚汉平曹永刚

中国民间疗法 2015年5期
关键词:心梗黄芩心肌细胞

马 萍 纪 中 戚汉平 曹永刚 黄 伟

(哈尔滨医科大学,黑龙江 大庆 163319)

心血管疾病的发病率逐年上升,已经成为继肿瘤之后威胁全人类健康的第二大疾患。其中因冠心病死亡的占其死亡总数的50%左右,且呈上升趋势,心肌梗死是冠心病中常见的严重类型。临床上寻找新的更有效、更安全、更经济的防治方法仍是研究的热点问题。黄芩苷具有抗氧化、抗炎、保护缺血后受损心肌细胞的作用,临床上已经广泛运用于各种心血管疾病的治疗。本课题旨在研究黄芩苷预处理对大鼠心肌的保护作用及其调控机制,为黄芩苷的开发研制及心肌梗死(AMI)的防治提供理论依据。

材料

1.药品及试剂:黄芩苷(嘉迪欧公司提供,批号:GDL20120224A),Bax及Bcl-2小鼠抗大鼠单克隆抗体(购于Abcam),GAPDH兔抗大鼠多克隆抗体(购于Santa Cruz),RNA试剂盒、荧光定量PCR试剂盒及引物设计(均为TaKaRa产品)。

2.动物与分组:30只健康Wistar大鼠(由哈尔滨医科大学动物中心提供),体重210~230g,随机分为三组,每组10只。假手术组(Sham)、心肌梗死模型组(简称心梗模型组)(MI)、黄芩苷组(BAI)。各组依次连续4周分别灌胃给药生理盐水、BAI 400mg/kg·d,末次给药30min后建立大鼠急性心肌梗死模型。

方法

1.心肌梗死模型的制备:Wistar大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠40mg/kg麻醉,颈部至剑突去毛,分离气管,连接麻醉呼吸机,开胸后进行辅助呼吸。呼吸频率16~18次/min,吸气/呼气比为1∶2,潮气量350~550mL。连接心电图导联,分别为右上肢、左下肢、腹部(肢体Ⅱ导联),在大鼠胸骨左缘第3、4肋间开胸暴露心脏,轻压挤出心脏,5/0号细线结扎冠状动脉左前降支起始端,迅速将心脏放回胸腔,排出空气,闭胸[1]。假手术组只穿线不结扎。

2.Western blotting检测 Bax及 Bcl-2蛋白水平,提取心肌总蛋白,BCA-100法测定蛋白含量。取100μg等量蛋白经10%SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜上,用含5%脱脂奶粉封闭1h后分别与小鼠抗大鼠Bax、Bcl-2及兔抗大鼠GAPDH抗体(以TBS稀释,浓度分别为1∶500、1∶200)室温孵育2h;洗膜后与二抗(兔抗小鼠及山羊抗兔IgG)室温孵育1h,化学发光显影,凝胶成像系统拍照、扫描分析。以目的条带和GAPDH条带吸光度比值作为半定量结果。

3.荧光定量PCR半定量检测心肌肌钙蛋白(cTn-T)mRNA表达:提取心肌总RNA,计算RNA的纯度,进行逆转录反应(TaKaRa),合成的cDNA储存在-20℃条件下备用。以β-actin为内参照,引物如下:cTn-T上游5’-ACC TAT GCC GGC AGC TTC A-3’,下游5’-GAG AGT GGG CCG CTT AAA CTT G-3’,β-actin 上 游 5’-GCG AGA AGA TGA CCC AGA TC-3’,下 游 5’-CCA GTG GTA CGG CCA GAG G-3’。合成cDNA。定量PCR检测为20μL反应体系,反应液中包括 SYBR Premix Ex TaqTM 10μL,PCR forward primer及PCR reverse primer各0.4μL,Rox Referance Dye 0.4μL,ddH2O 6.8μL,模 板cDNA 2μL。cTn-T及β-actin的PCR反应条件为95℃30s,1个循环,95℃10s、62℃31s45个循环。

4.标准曲线的制备,将PCR产物按照1/5倍浓度梯度进行稀释,选择10 000、2000、400、80、16、3.2浓度的稀释产物作为标准模板,进行荧光定量PCR反应。通过这6个标准品生成的反应数据,绘制标准曲线[2]。

结果

1.Western blotting检测 Bax及 Bcl-2蛋白水平,心梗模型组大鼠心肌细胞Bax蛋白表达高于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05);黄芩组大鼠心肌细胞Bax蛋白表达低于心梗模型组(P<0.05);心梗模型组大鼠心肌细胞Bcl-2蛋白表达低于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05);黄芩苷组大鼠心肌细胞Bcl-2蛋白表达高于心梗模型组(P<0.05)。见表1。

表1 黄芩苷对心肌梗死大鼠心肌细胞Bax及Bcl-2蛋白表达的影响(±s)

表1 黄芩苷对心肌梗死大鼠心肌细胞Bax及Bcl-2蛋白表达的影响(±s)

注:*与心梗模型组比较,*P<0.05

分组 例数 Bax/GAPDH Bcl-2/GAPDH假手术组 10 0.6±0.082* 1.8±0.095*心梗模型组 10 1.5±0.079 0.9±0.086黄芩苷组 10 0.8±0.094* 1.3±0.072*

2.绘制标准曲线:以不同定量模板起始浓度的对数(lgC)为横坐标,以CT值为纵坐标,得到标准曲线,相关系数R2=0.9968,符合要求。

3.实时荧光定量PCR测定结果:根据不同组中cTn-T的CT值,从标准曲线上计算出每组样品的浓度,进而计算出目标基因和内参基因浓度的比值。心梗模型组大鼠心肌细胞cTn-T mRNA表达明显低于假手术组(P<0.01),黄芩苷组大鼠心肌细胞cTn-T mRNA表达高于心梗模型组,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 黄芩苷对心肌梗死大鼠心肌细胞cTn-T mRNA表达的影响(±s)

表2 黄芩苷对心肌梗死大鼠心肌细胞cTn-T mRNA表达的影响(±s)

注:与心梗模型组比较,*P<0.05,**P<0.01

分组 例数 cTn-T/β-actin mRNA假手术组 10 2.43±0.95**心梗模型组 10 0.63±0.26黄芩苷组 10 1.78±0.89*

讨论

急性心肌梗死(AMI)是严重威胁人类生命的主要疾病之一。近年来研究发现,缺血、缺氧以及缺血再灌注过程中心肌细胞除发生坏死外,还可诱发和(或)启动心肌细胞凋亡。细胞凋亡受基因的调控,表现为凋亡信号通路的启动和相关基因的表达。在不同的因素刺激下,参与诱导心肌细胞凋亡的调控基因不尽相同。介导细胞凋亡的信号传导通路有多条,且它们之间存在相互联系。凋亡信号的刺激,一方面通过细胞内酶促级联反应,活化特异性核酸内切酶和转录因子,引起细胞发生凋亡的形态与生化改变;另一方面活化凋亡调控基因表达。

Bax是Bcl-2的同源体,可抑制Bcl-2的作用,促进细胞凋亡。本研究显示AMI后,心梗模型组大鼠心肌组织的Bax基因蛋白表达高于假手术组(P<0.05)。Bax表达促进细胞凋亡可能通过以下几种机制实现:①Bax与Bcl-2形成异源二聚体,抑制Bcl-2作用,还可能抑制Bcl-2家族中如Bcl-xL等其他抑制凋亡基因的作用;②Bax/Bax同源二聚体的形成,抑制线粒体细胞色素C释放,促进细胞凋亡;③Bax本身具有促进细胞凋亡的作用。

Bcl-2家族是公认的凋亡抑制基因,可抑制多种因素如氧自由基和p53诱导的细胞凋亡,也可以减少缺血再灌注心肌细胞的凋亡。本实验结果显示,AMI后心肌组织的Bcl-2蛋白低于假手术组水平(P<0.05)。提示Bcl-2对心肌细胞具有保护作用,诱导心肌细胞表达Bcl-2已成为探索心肌保护措施的新途径。

cTn-T存在于心肌细胞的细肌丝中,是心肌肌钙蛋白复合体中的一种多肽亚单位,分子量为37KD,cTn-T作为心肌细胞所特有的一种调钙蛋白,完全具有心肌组织特异性并具有高度敏感性,因此是评价心肌坏死的首选标志物[3]。本实验结果显示AMI后心梗模型组大鼠心肌细胞cTn-T mRNA表达明显低于假手术组(P<0.01),提示心肌组织坏死。

黄芩苷属黄酮类,是从中药黄芩中提取的主要成分,黄芩苷的药理作用体现在很多方面,主要是抗氧化、清除自由基、抗炎、抗肿瘤、阻止钙离子通道、抑制醛糖还原酶、抗病毒、抗过敏等,并对免疫、心脑血管、消化、神经等系统具有保护作用。近年关于黄芩苷在心、脑血管系统作用的实验研究日益增多,Peng及其同事近期研究证实:口服黄芩苷能通过抗氧化机制有效保护心脏缺血性损伤。在一项体外研究中,黄芩苷预处理可通过抗炎机制减轻培养的大鼠心肌细胞凋亡[4]。在我们研究中在体预防给药后发现,黄芩苷组与心梗模型组相比,Bax蛋白表达降低(P<0.05)、Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05)、cTn-T mRNA表达升高(P<0.05)。提示黄芩苷可能通过上调cTn-T mRNA 表达,上调Bcl-2蛋白、下调Bax蛋白表达,从而抑制心梗后心肌细胞凋亡的发生,这应是其保护心肌细胞,防治心肌梗死的作用机制之一。

[1]李贻奎,赵乐,何萍,等 .提高结扎冠状动脉在体大鼠心肌梗死模型制作速度和质量的研究[J].中国中西医结合杂志,2012,32(7):948-950.

[2]马萍,纪中,纪长伟,等 .蓝莓花色苷预处理对心肌梗死大鼠的保护作用[J].中国比较医学杂志,2013,23(6):49-52.

[3]曾红莲,李露明,班正贺 .心肌肌钙蛋白T检测对急性心肌梗死的诊断价值[J].当代医学,2011,17(1):29-30.

[4]Lin L,Wu XD,Davey AK,et a1.The anti-inflammatory effect of baicalin on hypoxia/reoxygenation and TNF-alpha induced injury in cultural rat cardiomyopathy[J].Phytother Res,2010,24(3):429-437 .

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