杨文婧　赵瑞力

[摘要] 目的 探讨喉鳞状细胞癌组织中Twist2、β-cadherin、E-cadherin的表达及其意义。 方法 应用免疫组织化学S-P法检测Twist2、β-cadherin、E-cadherin在48例喉鳞状细胞癌组织及30例癌旁正常组织中的表达情况，分析其在不同组织中的相互关系及与喉鳞状细胞癌临床参数的关系。 结果 Twist2、β-cadherin、E-cadherin在喉鳞状细胞癌及癌旁正常组织中的阳性表达率比较差异有统计学意义（P<0.01）；喉鳞状细胞癌中Twist2、β-cadherin及E-cadherin的阳性表达率在有无淋巴结转移、临床分期中差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；在不同临床分型及年龄间差异无统计学意义（P>0.05）；喉鳞状细胞癌中Twist2的阳性表达与β-cadherin的阳性表达呈负相关（r=-0.434，P=0.005），与E-cadherin的阳性表达亦呈负相关（r=-0.344，P=0.034）。 结论 Twist2与β-cadherin、E-cadherin在喉鳞状细胞癌发生、浸润及转移过程中起重要作用，Twist2与β-cadherin、E-cadherin的协同作用可能影响喉鳞状细胞癌的浸润和转移。

[关键词] 喉鳞状细胞癌；Twist2；β-cadherin；E-cadherin；免疫组化

[中图分类号] R739.65 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）08（c）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significances of Twist2，β-cadherin and E-cadherin in LSCC. Methods The expression of Twist2，β-cadherin and E-cadherin were detected by immunohistochemistry S-P method in 48 tissue LSCC and 30 tumor-adjacent normal tissue.The relationship between three factors and clinical pathological features of LSCC were investigated. Results The differences of the positive rates of Twist2，β-cadherin and E-cadherin in LSCC and tumor-adjacent normal were statistically significant （P<0.01）；the positive expression rates of Twist2，β-cadherin and E-cadherin in lympha node metastasis，clinical stage in LSCC were statistically significant （P<0.05 or P<0.01）；no statistically significant difference between the different clinical type and age groups（P>0.05）.The positive expression of Twist2 was negatively related to that of β-cadherin （r=-0.434，P=0.005），and also negatively related to that of E-cadherin （r=-0.344，P=0.034）. Conclusion Twist2，β-cadherin and E-cadherin play important role in the occurrence，infiltration and metastasis of laryngeal squamous cell carcinoma.The synergistic effect of Twist2，β-cadherin and E-cadherin may have some effects on the infiltration and metastasis of laryngeal carcinoma.

[Key words] Laryngeal squamous cell carcinoma；Twist2；β-cadherin；E-cadherin；Immunohistochemistry

肿瘤的发生、发展是一个多基因、多步骤的过程。同其他恶性肿瘤一样，喉鳞状细胞癌的发生也是多基因、多因素、多条途径共同参与的复杂过程，抑癌基因失活与癌基因的激活并存，最终导致了正常细胞生长和分化失去控制，所以，目前从基因水平上了解喉鳞状细胞癌得到人们的高度重视。Twist2是碱性Helix-loop-helix（b-HLH）蛋白家族中的重要一员，近年来开始被关注。国内外研究发现，Twist2与上皮间质转化的发生及肿瘤的侵袭与转移有密切关系。但在与喉鳞状细胞癌的相关性研究还尚未见报道。本实验采用免疫组化S-P法检测喉鳞状细胞癌及癌旁正常组织中的Twist2、β-cadherin及E-cadherin蛋白的表达情况，探讨其在喉鳞癌的发生、浸润及转移中的作用及三者的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集48例喉鳞状细胞癌组织及癌旁正常组织30例，均来自于沧州市人民医院耳鼻喉科2010年2月～2013年5月的喉鳞状细胞癌手术切除标本和手术切除的距安全切缘1 cm以上的癌旁正常组织，并均经过病理检查确定。本研究已经医院伦理委员会通过。所有喉癌患者术前都未行放、化疗，临床资料完整。喉癌状细胞患者中有淋巴结转移者24例，无淋巴转移者24例；高分化（G1级）13例，中分化（G2级）19例，低分化（G3级）16例；Ⅰ+Ⅱ期患者18例，Ⅲ+Ⅳ期患者30例；声门上型17例，声门型31例。年龄41～80岁，中位年龄60.2岁。

1.2 主要试剂

Twist2鼠单克隆抗体（Twist2 C1a：sc-81417，Santa Cruz Biotechnology Inc）；β-cadherin、E-cadherin鼠单克隆抗体（ZM-0094，北京中衫金桥生物技术有限公司）；鼠二抗免疫组化试剂盒（SP-9002，北京中衫金桥生物技术有限公司）；DAB显色液（ZLI-9032，北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 方法

所选标本均制成石蜡标本，4 μm连续切片，一抗所选浓度Twist2、β-cadherin鼠单克隆抗体1∶100；E-cadherin鼠抗人单克隆抗体1∶50。采用免疫组织化学S-P法，严格遵守操作步骤进行实验。设置PBS代替一抗为阴性对照，作为质量控制标准，癌旁正常组织为正常对照组。

1.4 结果判定

Twist2在细胞质中阳性着色，阳性着色细胞会出现片状或颗粒状的胞质。结果采用半定量记分法判定[1]，按阳性着色程度、阳性细胞所占比例分别评分，再用两者的乘积来判定结果：<4分为阴性表达，4～12分为阳性表达。

β-cadherin、E-cadherin在细胞膜上阳性着色，阳性细胞会出现呈棕黄色颗粒状或线状均匀完整的胞膜着色。判定结果参考Fromowitz评分标准[2]，选取5个高倍视野（×400）得出阳性细胞百分率；再根据阳性细胞呈现的染色强度予以记分，最后将两项得分相加：<3分为阴性表达，≥3分为阳性表达。

1.5 统计学方法

所得数据均经Excel整理后采用SPSS 19.0统计软件进行分析。计数资料以率表示，采用χ2检验。相关性采用Spearman等级相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Twist2在喉鳞状细胞癌及癌旁组织中的表达

Twist2在喉鳞状细胞癌中阳性表达率为58.33%（28/48），高于癌旁正常组织中阳性表达率，差异有统计学意义（16.67%，5/30）（P<0.01）（表1）。在喉鳞状细胞癌中，Twist2在存在淋巴结转移的病例组（N+）的阳性表达率（83.3%）明显高于无淋巴结转移的病例组（N0）的阳性表达率（33.3%），差异有统计学意义（P<0.05）。根据TNM分期，喉鳞状细胞癌Ⅰ+Ⅱ期病例组的阳性表达率（22.2%）明显低于Ⅲ+Ⅳ期病例组（80.0%），差异有统计学意义（P<0.05），而与肿瘤病理学分级、临床分型及年龄分组无关（P>0.05）（表2）。

β-cadherin在喉鳞状细胞癌中阳性表达率为35.42%（17/48），低于癌旁正常组织中阳性表达率（100.00%，30/30），差异有统计学意义（P<0.01）（表1）。在喉鳞状细胞癌中，β-cadherin在存在淋巴结转移的病例组（N+）的阳性表达率（16.7%）明显低于无淋巴结转移的病例组（N0）的阳性表达率（54.2%），差异有统计学意义（P<0.05）。根据TNM分期，喉鳞状细胞癌Ⅰ+Ⅱ期病例组的阳性表达率（55.6%）明显高于Ⅲ+Ⅳ期病例组（23.3%），差异有统计学意义（P<0.05），而与肿瘤病理学分级、临床分型及年龄分组无关（P>0.05）（表2）。

E-cadherin在喉鳞状细胞癌中阳性表达率为22.92%（11/48），低于癌旁正常组织中阳性表达率（100.00%，30/30），差异有统计学意义（P<0.01）（表1）。在喉鳞状细胞癌中E-cadherin的表达与淋巴结转移（N+组低于N0组，P<0.01）、临床分期（Ⅰ+Ⅱ期高于Ⅲ+Ⅳ期，P<0.01）和病理分级（G2+G3级低于G1级，P<0.01）相关，而与临床分型及年龄分组无关（P>0.05）（表2）。Twist2、β-cadherin和E-cadherin在喉鳞状细胞癌及癌旁正常组织中的表达见图1～图3。

2.2 Twist2与β-cadherin、E-cadherin在喉鳞状细胞癌中的相关性

在48例喉癌中，Twist2、β-cadherin在5例喉鳞状细胞癌组织中均呈阳性表达，Twist2、β-cadherin在8例喉鳞状细胞癌中均呈阴性表达，Twist2表达阳性但β-cadherin表达阴性的喉鳞状细胞癌有23例，β-cadherin表达阳性但Twist2表达阴性的喉鳞状细胞癌有12例。Spearman相关分析显示，Twist2与β-cadherin呈负相关表达（r=-0.434，P=0.005）。

在48例喉鳞状细胞癌中，Twist2、E-cadherin在3例喉鳞状细胞癌组织中均呈阳性表达，Twist2、E-cadherin在12例喉鳞状细胞癌中均呈阴性表达，Twist2表达阳性但E-cadherin表达阴性的喉鳞状细胞癌组织有25例，E-cadherin表达阳性但Twist2表达阴性的喉鳞癌组织有8例。Spearman相关分析显示，Twist2与E-cadherin呈负相关表达（r=-0.344，P=0.034）。

3 讨论

在胚胎的发育过程中，上皮细胞之所以会逃避组织结构所造成的空间限制，是因为它会转变成另一种更加合适的细胞移动表型——间充质表型，这个过程即为上皮-间充质转型（EMT）。目前研究发现，EMT可以使不具有转移潜力和侵袭性的非恶性肿瘤细胞获取侵袭的能力，转移至其他器官。EMT被基质细胞外信号启动，这包括细胞外基质的组成成分和生长因子，EMT被EMT转录因子的激活物调节，如Twist1、Snail、Slug、ZEB1、ZEB2[3-6]。国外研究表明，Twist2与Twist1类似，可诱导EMT的发生，导致肿瘤的侵袭及转移[7]。最近研究发现，Twist2在卵巢癌中表达上调，很可能通过促进EMT转变，从而使间叶细胞标志物Vimentin、fibronectin表达增多，继而增加侵袭和转移的能力[8]。Twist2与甲状腺癌、乳腺癌的表达在国内外有相关报道[9-17]，但其在喉鳞状细胞癌中的表达尚未研究。本实验显示，Twist2在喉鳞癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常组织中的阳性表达率（P<0.01）。在喉鳞癌组织中Twist2阳性表达与淋巴结转移及TNM临床分期相关（P<0.05），但在临床分型、肿瘤病理学分级及年龄分组中差异无统计学意义（P>0.05）。此结果与毛宇彬等[8]报道的卵巢癌中Twist2的基因表达结果相一致。由此推断Twist2高表达的鳞状细胞癌组织具有更强的侵袭能力，Twist2可能成为判断喉鳞状细胞癌预防或预后的检测指标之一。

β-cadherin的羧基末端与E-cadherin胞内区结合，氨基末端与α-cadherin连接可形成E-cadherin/cadherin复合体从而稳定E-cadherin结构，促进细胞间的黏附连接。本实验发现，喉鳞状细胞癌中β-cadherin阳性表达明显低于癌旁正常组织，提示喉鳞状细胞癌的转移、侵袭能力越高，β-cadherin的阳性表达率越低。焦阳等[18]研究发现，在肝细胞癌中β-cadherin高表达，并且与临床分期、门静脉栓、肝外转移明显相关，与本实验结果相吻合。本实验结果表明，喉鳞状细胞癌中E-cadherin阳性表达明显低于癌旁正常组织，提示喉鳞状细胞癌的转移、侵袭能力越高，E-cadherin的阳性表达率越低。Rodrigo等[19]研究发现，在声门上型喉癌组织中E-cadherin表达下调与喉癌患者的临床参数，如颈巴结转移、分期、组织学分化程度及肿瘤复发均呈负相关，提示检测喉癌患者的E-cadherin的表达对于评估病情及制订临床治疗方案有重要意义。

EMT过程中，上皮细胞经历了重要的表型转变，E-cadherin和其他上皮细胞功能的组成结构表达的缺失及侵袭特性使它们转移至细胞外基质[20]。Twist2形成Twist1/Twist2/Mi2/NuRD蛋白复合物，其与E-box的启动子结合，下调E-cadherin的表达，导致EMT的发生[19]。β-catenin与E-cadherin链接形成复合体，对细胞间质起到稳固作用[21]，当β-catenin表达异常或功能丧失时，与E-cadherin的链接就会丧失，从而导致肿瘤的发生和侵袭[22]。本实验对Twist2、β-cadherin和E-cadherin三者的相关性分析发现，Twist2与E-cadherin及β-cadherin均呈负相关。Twist2参与喉鳞状细胞癌的发生、转移及浸润可能通过上调E-cadherin同时下调β-cadherin介导发生EMT。联合检测喉鳞状细胞癌组织中Twist2、β-cadherin和E-cadherin的表达情况对患者的诊疗与预后具有指导意义。

[参考文献]

[1] 赵杰，杨春雨，王丽华，等.Twist蛋白、E-cadherin、VEGF在食管鳞状细胞癌中的表达[J].辽宁医学院学报，2008， 29（6）：506-508.

[2] 李娜萍，吴人亮，郝春荣，等.博莱霉素致小鼠肺组织损伤时广谱钙黏附素与β连环素的表达[J].中华结核和呼吸杂志，2001，24（10）：599-601.

[3] Maeda M，Johnson KR，Wheelock MJ.Cadherin switching：essential for behavioral but not morphological changes during an epithelium-to-mesenchyme transition[J].Cell Sci，2005，118（5）：873-887.

[4] Thiery JP，Sleeman JP.Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2006， 7（3）：131-142.

[5] Ouyang G，Wang Z，Fang X，et al.Molcular signaling of the epithelial to mesenchymal transition in generating and maintaining cancer stem cells[J].Cell Mol Life Sci，2010，67（15）：2605-2618.

[6] Lee MS，Lowe G，Flanagan S，et al.Human Dermo1 has attributes similar to twist in early bone development[J].Bone，2000，27（5）：591-602.

[7] Li L，Cserjesi，Olson，et al.Dermo-1：a novel twist-related bHLH protein expressed in the developing dermis[J].Dev Biol，1995，172（1）：280-292.

[8] 毛宇彬，刘祖国，鲍仕登，等.转录因子Dermo1、Twist在多种人类肿瘤中的功能分析与甲基化调控机制[J].中华肿瘤防治杂志，2008，15（16）：1259-1274.

[9] Martin TA，Goyal A，Watkins G，et al.Expression of the transcription factors snail，slug，and twist and their clinical significance in human breast cancer[J].Ann Surg Oncol，2005， 12（6）：488-496.

[10] Lee TK，Poon RT，Yuen AP，et al.Twist overexpression correlates with hepatocellular carcinoma metastasis through induction of epithelial-mesenchymal transition[J].Clin Cancer Res，2006，12（18）：5369-5376.

[11] Vasko V，Espinosa AV，Scouten W，et al.Gene expression and functional evidence of epithelial-to-mesenchymal transition in papillary thyroid carcinoma invasion[J].Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（8）：2803-2808.

[12] Castro AC，Rosivatz E，Schott C，et al.Slug is overexpressed in gastric carcinomas and may act synergistically with SIP1 and snail in the down-regulation of E-cadherin[J].J Pathol，2007，211（5）：507-515.

[14] Higashikawa K，Yoneda S，Taki M，et al.Gene expression profiling to identify genes associated with high-invasiveness in human squamous cell carcinoma with epithelial-to-mesenchymal transition[J].Cancer Lett，2008，264（2）：256-264.

[15] Song LB，Liao WT，Mai HQ，et al.The clinical significance of twist expression in nasopharyngeal carcinoma[J].Cancer Lett，2006，242（2）：258-265.

[16] Eckert MA，Yang J.Targeting invadopodia to block breast cancer metastasis[J].Oncotarget，2011，2（7）：562-568.

[17] Maestro R，Dei Tos AP，Hamamori Y，et al.Twist is a potential oncogene that inhibits apoptosis[J].Genes Dev，1999， 13（17）：2207-2217.

[18] 焦阳，班克臣，曹骥，等.肝细胞癌组织中β-catenin 的表达与第三外显子突变的关系[J].癌症，2007，26（10）：1085 -1089.

[19] Rodrigo JP，Dominguez F，Alvarez C，et al.Expression of E-cadherin in squamous cell carcinomas of the supraglottic larynx with correlations to clinicopathological features[J].Eur J Cancer，2002，38（8）：1059-1064.

[20] Smit MA，Peeper DS.Epithelial-mesenchymal transiton and senescence：two cancer-related processes are crossing path[J].Aging（Albany NY），2010，2（10）：735-741.

[21] Evans-Metcalf ER，Brooks SE，Reale FR，et al.Profile of women 45 years of age and youger with endometrial cancer[J].Obstet Gynecol，1998，91（3）：349-354.

[22] Ikeguchi M，Makino M，Kaibara N.Clinical significance of E-caderin-catenin complex expression in metastatic foci of colorectal carcinoma[J].J Surg Oncol，2001，77（3）：201-207.

（收稿日期：2015-06-11 本文编辑：卫 轲）