吴成将陈健明蓝艳罗宏成向阳王春芳韦叶生★

广西壮族及汉族人群CD40配体基因rs7050168G/A遗传多态性

吴成将1陈健明1蓝艳2罗宏成1向阳1王春芳1韦叶生1★

目的 研究CD40配体基因rs7050168G/A位点多态性在广西壮族及汉族人群中的分布，同时比较其在不同种族人群间以及同一种族不同性别之间，基因型和等位基因频率分布的差异。

方法采用单碱基延伸PCR（PCR-SBE）的方法，分析201名广西汉族人和199名广西壮族人的CD40配体基因rs7050168G/A多态性。 结果 CD40配体基因rs7050168G/A位点表现出AA、AG和GG三种基因型，其在壮族人中的频率分别为97.0%、1.5%和1.5%，而在汉族人中频率分别为98.0%、1.0%和1.0%。CD40配体基因多态性在在广西壮族和汉族人群之间比较差异都没有显著性（P均＞0.05）。进一步将广西汉族人群分型数据同人类基因组计划公布的4个人群相比，我们发现在广西汉族人群中CD40配体基因rs7050168G/A位点基因型和等位基因频率与日本和北京人群比较，差异均具有显著性 （P均＜0.05），但与欧洲和非洲人群比较，差异没有显著性（P均＞0.05）。 结论 在广西地区壮族及汉族人群中存在着CD40配体基因多态性，其基因多态性的分布频率没有显著性的差异，但与其他种族人群比较存在着显著差异。这种差异可能是导致一部分疾病在不同种族人群之间的临床表现以及发病率存在显著不同的因素之一。

CD40；基因多态性；种族

［ABSTRACT］Objective To study gene polymorphism at rs7050168G/A of CD40 ligand in Guangxi Zhuang and Han populations，and to compare distributions of allele and genotype frequencies among different races and different gender in the same race.Methods The frequency of CD40 ligand gene rs7050168G/A allele and genotype were detected by using the method of polymerase chain reaction-single base extension （PCR-SBE）in 201 Guangxi Han and 199 Guangxi Zhuang populations.Results The genotype frequencies of AA，AG and GG of rs7050168G/A was 97.0%，1.5%and 1.5%in the Zhuangs，and 98.0%，1.0%and 1.0%in the Hans respectively.The frequencies of allele and genotype distribution of CD40 ligand geners7050168G/A polymorphism were not significant difference between the Zhuangs and the Hans （P＞0.05）.There were significant difference as compared with HapMap-JPT and HapMap-HCB （both P＜0.05），but compared with HapMap-CEU and HapMap-YRI，the CD40L polymorphism were not significantly difference （P＞0.05）.Conclusion There are CD40 ligand gene polymorphism in Guangxi Zhuang and Han populations.The frequencies of polymorphism distribution of CD40 ligand gene were not significant difference between the Zhuang and Han populations， whose distributions are significantly difference compared with others ethnic populations.The variation of CD40 ligand gene polymorphism among different ethnic groups might account for the varied clinical spectrum of some CD40 ligand related diseases.

［KEY WORDS］CD40 ligand；Polymorphism；Ethnic

CD40配体即CD40L，是TNF超家族的主要成员之一，表达于CD4+T细胞、柱状细胞、血管内皮细胞、单核细胞、自然杀伤细胞和血小板上，是一种分子量为39KD的Ⅱ型跨膜糖蛋白。CD40配体是体液和细胞免疫的中枢分子，与其受体CD40相互作用，作为T、B细胞活化的第二信号，介导T细胞依赖的B细胞活化和效应T细胞产生，在体液免疫和细胞免疫调节中发挥着重要的作用。人CD40配体基因定位于 X染色体的 q26.3-q27.1区，由5个外显子和4个内含子组成。分子生物学研究表明，CD40配体基因存在着单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），这种基因多态性与人类类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、肾移植排斥反应及多发性硬化症的关系，已成为国内外专家学者研究的热点［1-5］。因此本研究采用单碱基延伸的PCR技术和基因测序法来研究广西地区壮族及汉族两个种族人群的CD40配体基因单核苷酸多态性，并将其分型数据与人类基因组计划已经公布的4组人群（欧洲人、非洲人、日本人和中国北京人）进行比较，以探讨基因多态性在不同种族正常人群中的分布差异为与CD40配体相关的疾病和遗传等方面的研究提供一些基础性的参考资料。

1 对象与方法

1.1 对象

随机选取了来自广西各地区在我院体检健康且相互之间无血缘关系的400人。其中选取了广西汉族男性109人，女性92人，共201人，年龄均在22～84岁；广西壮族男性116人，女性83人，共199人，年龄均在25～83岁。所有对象的临床和实验室指标均在正常范围内。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取

用EDTA-K2抗凝管采集以上人群静脉血3 mL，全血基因组DNA提取，参照已建立的改良碘化钠法［6］。

1.2.2 引物设计与合成

根据CD40配体基因rs7050168G/A位点多态性和已知的DNA序列，用在线Primer3软件（http：//frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3www.cgi）设计PCR引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。用于特异性扩增 CD40配体基因包含rs7050168G/A位点碱基的DNA片段的引物，上游引物序列为：5′-CTTTTCCCCTGGGACCCAATT T-3′；下游引物序列为：5′-AATACCCCATGAGG CCCATTTC-3′；延伸引物为：5′-TTCCTCCTTT TGTCCCTCTAAGTCCCA-3′。

1.2.3 PCR扩增

CD40配体的PCR扩增反应体系为20 μL，其中包含了 10×PCR缓冲液2.0 μL，0.3 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上游引物、下游引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，TaqDNA聚合酶1.0 U，不足体积均用灭菌双蒸水补足至20 μL。PCR产物用Qiagen公司的HotStarTaq进行多重PCR来获得，PCR产物通过虾碱酶（SAP）（from Promega）和外切酶I（EXO I）（from Epicentre）经过纯化后，用ABI公司的 SNaPshot Multiplex kit进行延伸反应。延伸产物采用虾碱酶（SAP）（from Promega）纯化后在 ABI3130XL上样。SNP分型采用GeneMapper4.0（Appliedbiosystems）来分析。

1.3 统计分析

CD40配体基因型和等位基因频率均采用基因直接计数法计算，各组间基因型和等位基因频率比较均采用χ2检验，用SPSS 11.5软件包进行分析，P＜0.05认为具有统计学上的意义。

2 结果

2.1 CD40配体基因型检测结果

CD40配体基因 rs7050168G/A多态性，PCR扩增产物片段大小为297bp。经ABI3130XL基因检测仪SNP分型，其结果显示出rs7050168G/A位点检测到了AA、AG和GG三种基因型。基因测序进一步验证了我们的分型结果 （图 1）。

图1 CD40配体基因rs7050168G/A测序图

2.2 CD40配体基因多态性在广西壮族和广西汉族人群中分布频率的比较

根据人类基因组CD40配体基因SNP的数据库资料，我们选择rs7050168G/A位点进行多态性的分析。这个多态性位点的基因型和等位基因频率在男女之间比较，差异都没有显著性 （P均 ＞0.05）。同时这个多态性位点的基因型分布和等位基因频率在广西壮族和汉族人群之间比较，差异同样没有显著性（P＞0.05），见表1。

表1 广西壮族和汉族人群CD40配体基因rs7050168G/A基因型和等位基因分布频率的比较Table 1 Comparisons of distribution of genotype and allele frequencies of CD40 ligand gene rs7050168G/A in Guangxi Zhuang and Han populations

2.3 CD40配体基因多态性在不同种族人群间的比较

将广西汉族人群CD40配体基因多态性分布频率分别与人类基因组计划公布（Hapmap）的4个种族人群比较，结果显示CD40配体基因的基因型和等位基因频率同日本和北京人群相比，差异都有显著性 （P均＜0.05），但同欧洲及非洲人群相比，差异都没有显著性（P均＞0.05）。此外，我们将CD40配体基因rs7050168G/A多态性位点的基因型及等位基因频率在非洲人群和广西壮族人群间比较，发现等位基因频率存在着统计学差异 （P＜0.05），见表2。

表2 不同种族及地区人群CD40配体基因rs7050168G/A多态性分布频率的比较Table 2 Comparisons of frequency of CD40 ligand gene rs7050168G/A polymorphism among different ethic and regional groups

3 讨论

在人类基因组中，基因多态性是一种常见的现象，其在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性，疾病临床表现的多样性，以及对药物治疗的反应性上都起着重要的作用。而在研究某些疾病基因的多态性分布时，首先了解其在不同种族正常人群中的分布情况，是正确分析疾病与基因多态性之间关系的基础。广西是一个多民族聚居的区域，有48个以上民族长期共存，其中有12个世居民族。通过对这些不同民族基因多态性的研究，有助于发现基因多态性在不同种族人群中的分布规律。因此，本文将CD40配体基因多态性在广西汉族和广西壮族人群中进行对比研究，从而为探索一些疾病在不同种族间的遗传规律，提供一些前瞻性的基础资料。

CD40配体也称gp39或CD40L，为肿瘤坏死因子超家族成员，主要存在于活化的CD4+T淋巴细胞表面，提供B淋巴细胞活化所必需的协同刺激信号， 在巨核细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、外周血嗜碱性粒细胞、平滑肌细胞、B细胞、和单核细胞的表面也有少量表达。大量研究发现，CD40配体是一个重要的致病因子，通过与其受体CD40特异性结合而在许多疾病形成和发展过程中发挥着关键的作用，如通过诱导干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6、IL-8等细胞粘附分子在活化的平滑肌细胞和内皮细胞上的表达而启动动脉粥样硬化；此外也参与移植排斥反应、内皮损伤、血小板活化、血栓形成、血管形成、脑损伤等病理过程［7-9］。CD40配体基因位于X染色体的q26.3-q27.1包含5个外显子和4个内含子，CD40配体基因存在着单核苷酸多态性（SNP），这种基因多态性可能影响到CD40配体基因的功能，进而可能影响到CD40配体基因多态性与相关疾病的发生发展。Bilińska等［10］研究发现 CD40配体基因多态性影响着多发性硬化症等自身性疾病的发生和发展；Zhao［11］和王新等［12］研究表明CD40配体基因多态性与冠状动脉病变程度密切相关。

利用单碱基延伸PCR技术（PCR-SBE），我们对来自广西地区的壮族和汉族人群中CD40配体基因 rs7050168G/A多态性位点进行检测。将rs7050168G/A多态性位点的基因型和等位基因频率在广西壮族和汉族之间以及男女性别之间进行比较，结果表明差异均无显著性（P均＞0.05）。进一步研究发现广西汉族人群的rs7050168G/A多态性位点的基因型和等位基因频率与日本和北京人群比较，差异都具有显著性（P均＜0.05），但同欧洲和非洲人群比较，差异没有相关性 （P均＞0.05）。此外CD40配体基因rs7050168G/A多态性位点的等位基因频率在非洲人群和广西壮族人群之间也存在着显著差异（P＜0.05），造成此结果的可能原因是由于生存环境、饮食习惯、生活方式等的不同引起。从本文结果可以看出，CD40配体基因型分布和等位基因频率在不同种族间存在着明显的差异。

总之，对中国广西壮族和汉族人群CD40配体基因多态性的研究，不仅为CD40配体基因多态性与临床疾病相关性的研究分析提供了前瞻性的基础资料，而且也为进一步的人类学及群体遗传学的研究和基因多态性普查奠定了基础。

［1］Liao J，Liang G，Xie S，et al.CD40L demethylation in CD4+T cells from women with rheumatoid arthritis［J］.Clin Immunol，2012，145（1）：13-18.

［2］Winkels H，Weber C，Lutgens E，et al.Atherosclerosis：cell biology and lipoproteins focus on iNKT cells and CD40/CD40L in atherosclerosis and metabolic disorders ［J］.Curr Opin Lipidol，2014，25（5）：408-409.

［3］Ohashi Y，Okazaki H，Sato T，et al.Function of CD40/ CD40L in peritubularcapillary ofrenalallograft rejection［J］.Transplant Proc，2001，33（1-2）：407-408.

［4］Wagner M， Wisniewski A， Bilinska M， et al.Investigation of gene-gene interactions between CD40 and CD40L in Polish multiple sclerosis patients［J］.Hum Immunol，2014，75（8）：796-801.

［5］ 吴甜，郭韧，张毕奎.CD40/CD40L基因及其多态性与动脉粥样硬化的研究进展［J］.中南大学学报（医学版），2012，37（4）：413-418.

［6］ 蓝艳，罗斌，韦彩成，等.中国广西人群Nogo-B基因内含子区遗传多态性的研究［J］.中国现代医学杂志，2012，22（22）：1-4.

［7］Hausding M，Jurk K，Daub S，et al.CD40L contributes to angiotensin II-induced pro-thrombotic state，vascular inflammation，oxidative stress and endothelial dysfunction［J］.Basic Res Cardiol，2013，108（6）：386.

［8］Bou Khzam L，Boulahya R，Abou-Saleh H，et al.Soluble CD40 ligand stimulates the pro-angiogenic function of peripheral blood angiogenic outgrowth cells via increased release of matrix metalloproteinase-9［J］.Plos One，2013，8（12）：e84289.

［9］Lorente L，Martín MM，González-Rivero AF，et al.Serum soluble CD40 Ligand levels are associated with severity and mortality of brain trauma injury patients［J］.Thromb Res，2014，134（4）：832-836.

［10］Bilińska M， Frydecka I， Kosmaczewska A， et al.CD40L expression on CD4+T lymphocytes from peripheral blood in patients with relapsing-remitting and secondary progressive multiple sclerosis［J］.Pol Merkur Lekarski，2006，20（115）：41-45.

［11］Zhao W，Zhang F，Li Z，et al.Soluble CD40 ligand is associated with angiographic severity of coronary artery disease in patients with acute coronary syndrome［J］.Chin Med J（Engl），2014，127（12）：2218-2221.

［12］王新，刘群.中国人群CD40L G基因单核苷酸多态性对急性冠状动脉综合征影响的相关性研究［J］.中国动脉硬化杂志，2012，20（1）：64-68.

The genetic polymorphism of rs7050168G/A CD40 ligand gene in Guangxi Zhuang and Han populations

WU Chengjiang1，CHEN Jianming1，LAN Yan2，LUO Hongcheng1，XIANG Yang1，WANG Chunfang1，WEI Yesheng1★
（1.Department of Laboratory Medicine，Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise，Guangxi，China，533000；2.Department of Dermatology，Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise，Guangxi，China，533000）

国家自然科学基金（81260234）；广西自然科学基金（2011GXNSFA018198）；广西卫生厅重点科研课题 （重2012086）

1.右江民族医学院附属医院检验科，广西，百色 533000 2.右江民族医学院附属医院皮肤科，广西，百色 533000

韦叶生，E-mail：wysh22@163.com