张倩雯，王春霞，杨丽芸，黄卫东，战吉宬*（中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京 100083）

影响酿酒酵母发酵过程的因素分析

张倩雯，王春霞，杨丽芸，黄卫东，战吉宬*
（中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京 100083）

葡萄酒的酒精发酵主要是由酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）完成的，不同的培养条件会影响酿酒酵母的发酵效率。该文以模拟葡萄汁代替天然葡萄汁进行试验，考察环境温度、摇床转速以及发酵基质pH对酿酒酵母的影响。试验结果显示，在18～33℃温度范围内，随着温度的升高，发酵效率逐渐增大。28℃是最适宜酵母生长的温度条件。在50～150 r/min范围内，随着转速的增大，酵母的发酵效率逐渐增加，所需发酵时间逐渐缩短，以150 r/min为最适转速。在葡萄酒酿造常用的pH范围内，酿酒酵母的生长和发酵情况随pH的升高而增强，在pH值为4.0时达到最佳生长和发酵效率。

酿酒酵母；温度；转速；pH；发酵

葡萄酒的酿造主要是微生物代谢及其代谢物转变的过程［1］，葡萄酒的酒精发酵是由酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）完成的，因此酿酒酵母在葡萄酒的酿造过程中起非常重要的作用。在该过程中，酿酒酵母的行为受到外界培养条件的影响，不同的培养条件会在影响酵母生长的基础上影响葡萄醪的最终发酵产物。

目前大多数实验室和工业酵母都在20～30℃的条件下培养［2］，据报道，酿酒酵母的适宜生长温度是25～33℃，25～30℃对酵母繁殖比较有利，而30～37℃对酒精的产生有利［3］。因此有必要在25～37℃选取既利于酵母生长繁殖也能使其快速发酵产生酒精的温度。在实验室中，常使用摇床来进行发酵试验［1，4-7］。培养酿酒酵母使用摇床的目的之一是排出培养基中酵母生成的CO2，CO2能够通过影响酵母细胞内外的pH值、细胞膜及酶来抑制酵母的生长代谢［8］。而转速对酿酒酵母的生长与发酵状况也有一定影响［9］。pH值不仅可以作为发酵产物的指示指标，也可以作为发酵过程的指示指标。在葡萄醪的酒精发酵过程中，酵母将底物成分（糖、有机酸、氮等）转变成为酒精等代谢物的过程的热力学平衡都受到pH值的影响［10］。酵母适宜在微酸性的条件下生长，其适应pH范围为3.6～6.0，最适生长范围为pH 4.5～5.0，而在葡萄酒的酿造过程中，pH一般为3.3～3.5［11］。

虽然目前的研究已经得出能够影响酵母发酵过程的因素［12-15］，但是这些因素带来的具体影响比较复杂［14］。该实验对温度、pH值以及摇床转速对酿酒酵母发酵的影响进行研究，对获得酵母在发酵过程中的生物学性状，对指导生产以及建立葡萄酒酵母的筛选标准有重要意义［16］。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1试验菌株

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BH8：由本实验室分离并保存；商业酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AWRI R2和Freddo分别购自澳大利亚Marivin公司及德国Erbs1oh公司。本实验将酿酒酵母AWRI R2、BH8和Freddo重新编号为A、B、F。

1.1.2试验试剂

氢氧化钠（NaOH）、浓硫酸及配制培养基中所用试剂均为分析纯：北京化学试剂厂。

1.1.3培养基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptide dextrose，YPD）培养基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉20 g/L，121℃灭菌20 min。

模拟葡萄汁（mode1 synthetic medium，MSM）培养基（g/L）：配方参考文献［17］，121℃灭菌20 min。

1.2仪器与设备

AUY220分析天平、UV 1800紫外分光光度计；日本SHIMADZU公司；SKY-2102C恒温培养摇床；上海苏坤实业有限公司；pH211台式酸度计：意大利HANNA公司。

1.3方法

1.3.1酿酒酵母的发酵培养

取一环斜面保藏菌种转接到60 mL YPD液体培养基中。用三角瓶在一定温度、一定转速条件下进行摇床培养至对数中期（OD600nm值1.45～1.50）。取4 mL对数中期的酵母菌悬液至400 mL MSM培养基中，取不同时间的发酵液测定OD600nm值绘制标准曲线。称重瓶用装有浓硫酸的发酵栓封口，取样瓶用装有无菌水的发酵栓封口，根据试验设计在相应的温度、转速及pH条件下培养，其中，温度、转速通过设置恒温培养摇床参数调节，培养基质pH值通过向培养基中添加NaOH，以酸度计实时测量进行调节。

1.3.2酿酒酵母生长曲线的测定

接种前及发酵过程中每天取发酵液5 mL，以接种前的MSM培养基为空白对照，在波长600 nm处测定吸光度值OD600nm。

1.3.3酿酒酵母发酵性能的测定

利用菌株A、B、F在400 mL MSM培养基中相应的CO2释放量，以此表示酵母的发酵性能。连续两天质量差值小于0.02 g时认为发酵结束。采用二氧化碳失重法测定，即发酵过程中酿酒酵母产生的CO2通过装有浓硫酸的发酵栓释放出去，导致称重瓶内整体质量损失，单日称重瓶整体质量损失即代表其当日发酵性能［18］。

1.3.4酿酒酵母培养温度梯度设置

A菌株适用于红葡萄酒的酿造，其最适生长温度范围是18～25℃；F菌株适用于白葡萄酒的酿造，在温度范围13～17℃时，发酵表现最好；该试验设置温度梯度为18℃、23℃、26℃、28℃、33℃。设置恒温培养摇床转速为120r/min，发酵pH值为4。

1.3.5转速梯度设置

由多数参考文献可知当转速大于150 r/min时，不同转速对酿酒酵母的发酵表现无显著影响［19］。该试验设置转速梯度为0、50 r/min、100 r/min、120 r/min，150 r/min，设置恒温培养摇床温度为28℃，发酵pH值为4。

1.3.6pH梯度设置

葡萄酒的酿造过程中，pH常被控制在3.3～4.0之间，通过向MSM培养基中添加NaOH调节pH值，设置用于测量酿酒酵母生长曲线的取样瓶内培养基pH梯度为3.1、3.4、3.7、4.0；另设置用于测量酿酒酵母发酵效率的称重瓶内培养基pH梯度为2.8、3.1、3.4、3.7、4.0。设置恒温培养摇床转速为120 r/min，温度为28℃。

1.3.7数据处理

试验结果采用SPSS 17.0进行方差分析和显著性差异分析，显著水平0.05；采用SigmaP1ot 12.0绘制图表。

2　结果与分析

2.1不同温度对酿酒酵母发酵过程的影响

2.1.1不同温度条件下酿酒酵母的生长曲线

OD600nm的大小可以反映出MSM培养基中酿酒酵母细胞的浓度，对不同培养时间的菌液进行测定，了解菌株A、B、F在不同培养温度下的基本生长情况。结果如图1所示。

图1　不同温度条件下酿酒酵母的生长曲线Fig.1 Growth curves ofSaccharomyces cerevisiaeunder different temperatures

由图1可见，培养的温度条件不同导致酵母的生长状况也不同。发酵所需时间随温度的升高而递减；酵母在对数生长期时的生长速度在18～33℃范围内随温度的升高而递增，33℃条件下酵母在第3天即从对数生长期进入稳定期，23℃、26℃、28℃温度条件下酵母生长均在第4天进入稳定期，而18℃温度条件下的酵母生长则在第6天才进入稳定期，并且生长的延滞期相对于其他温度延长了一天。温度设置为23℃、26℃、28℃的培养基中酿酒酵母所能达到的生物量较高，18℃培养的酵母生长进入稳定期之后酵母生物量仍在缓慢上升，逐渐接近23～28℃温度条件下酵母进入稳定期后的生物量，而33℃条件下培养的酵母生长迅速，最早进入稳定期，但所能达到的生物量较低。28℃条件下培养的酵母前期的生物量增长仅次于33℃，酵母生长速度高于26℃条件下生长速度。不同菌株的酿酒酵母生物量达到最大的温度条件不同，菌株A、F的在26℃发酵的第6天达到，OD600nm值分别为2.310和2.314；而菌株B的最大生物量在28℃发酵的第6天达到，OD600nm值为2.288。

2.1.2不同温度条件下酿酒酵母的发酵效率

图2　不同温度条件下酿酒酵母发酵过程中的单日质量损失Fig.2 Daily mass loss ofS.cerevisiaeunder different temperatures conditions

图2为不同温度条件下A、B、F三株酿酒酵母发酵过程中的单日质量损失结果。根据图2的趋势可以看出，单日质量损失都随着发酵时间的延长而先升高后降低。33℃条件下在发酵的第1天，各菌株的质量损失都明显高于其他温度组，分别是28℃发酵第1天质量损失的166%（A）、187%（B）、189%（F）。不同温度条件下达到最大单日质量损失所需时间不同，发酵温度为26℃、28℃、33℃时在第2天质量损失最大，分别为10.97～12.27 g、12.14～13.29 g、10.96～12.84 g。而23℃时在第3天质量损失最大，为8.74～9.72 g。在18℃温度条件下，在第4天质量损失最大，为6.23～6.56g。其中28℃发酵的最大单日质量损失为所有温度梯度中最高，其次依次为33℃、26℃、23℃、18℃。随着温度的降低，发酵所需时间延长，中后期的单日质量减少趋势也变得缓慢。当发酵过程中单日质量损失小于0.1 g后，发酵仍将持续6 d左右。

根据试验所得数据分析可知，在不同温度条件下，各菌株单日质量损失有显著性差异（P＜0.05），因此，温度对酵母的发酵过程有显著影响。综合而言，28℃是A、B和F 3株酵母的最适发酵温度，该结果与YALCIN S K等［3］的试验结果吻合，此外，3株酵母的发酵能力大小为B＞F＞A。在该温度下，酵母在对数期的生长较快，需要较短的时间即可进入生长的稳定期，并能达到比较高的生物量水平；单日质量损失大即发酵速度快。培养温度的降低会延长酵母的延滞期，减慢发酵速度，使酿酒酵母虽然同样可以达到较高的生物量［13］，但是该过程需要较长的时间。其原因可能是低温影响了酵母中酶的活性，糖的转运速度下降［5］。酿酒酵母对酒精的敏感性随温度的升高而增强［15］，这可能是由于培养温度升高导致发酵不完全。在经过一段时间的发酵后，培养液中已经积累了较高浓度的酒精，由于酵母在高温下受到酒精的胁迫较强而停止发酵。

2.2不同转速对酿酒酵母发酵过程的影响

2.2.1不同转速条件下酿酒酵母的生长曲线

菌株A、B、F在不同转速条件下培养的基本生长情况见图3。

由图3可以看出，在所设置的转速梯度条件中，酵母生长进入稳定期的时间相对一致，均为第4天；转速从0至150 r/min范围内随转速的增大，达到的最大酵母细胞浓度逐渐上升，在0～100 r/min的范围内，转速每提高50 r/min 的OD600nm值升高0.3左右；酿酒酵母菌株A、B、F在150 r/min条件下酵母最大生长量对应的OD600nm值分别为2.238、2.259、2.290，与120 r/min的数据差异不大，二者的生长曲线相关性检验结果为无显著性差异（P＞0.05）。菌株A的最大生长量发生在150 r/min，而菌株B和F的最大生长量发生在120 r/min。在大于50 r/min的条件下，随转速的增大，发酵所耗时间变短。

图3　不同转速条件下酿酒酵母的生长曲线Fig.3 Growth curves ofSaccharomyces cerevisiaeunder different shaking speeds conditions

2.2.2不同转速条件下酿酒酵母的发酵效率

图4　不同转速条件下酿酒酵母发酵过程中的单日质量损失Fig.4 Daily mass loss ofSaccharomyces cerevisiaeunder different shaking speeds conditions

图4为不同转速条件下，菌株A、B、F在MSM培养基中相应的CO2释放量。由图4可以看出，酵母单日质量损失随着发酵时间的延长先迅速升高后缓慢降低。150 r/min和120 r/min条件下的最大单日质量损失均发生在第3天，且质量损失相当，分别为12.53～13.32 g、12.14～13.29 g；其次为100 r/min条件下最大单日质量损失发生在发酵第3天，为9.98～11.75 g；50 r/min条件下最大单日质量损失5.37～6.01 g和0转速条件下质量损失4.58～5.01 g，分别发生在发酵第3天和发酵第4天。此外，转速在150 r/min条件下发酵所需时间最短；随转速降低，发酵所需时间逐渐延长。

摇床能够加速发酵过程中产生的CO2的排出，并能够使酵母悬浮在培养液中，在一定程度上增加菌液浓度。低转速情况下酿酒酵母的生长和发酵情况较差可能由于CO2未能及时排除，胁迫酿酒酵母，影响到其生长和发酵来解释［8］。可以得出在150 r/min条件下，A、B、F 3株酵母的生长状况良好且发酵效率最高。

2.3不同pH值对酿酒酵母发酵过程的影响

2.3.1不同pH值条件下酿酒酵母的生长曲线

菌株A、B、F在不同pH值培养条件下的基本生长情况见图5。

图5　不同pH条件下酿酒酵母的生长曲线Fig.5 Growth curves ofSaccharomyces cerevisiaeunder different pH conditions

由图5可知，3株酿酒酵母在不同pH值条件下，均在第2天就进入生长稳定期，生物量在第6天达到最高，OD600nm值约为2.5。经过对数据分析可知，在不同的pH条件下进行的发酵，各菌株在不同pH值条件下所测得的值无显著性差异（P＞0.05）。

2.3.2不同pH条件下酿酒酵母的发酵效率

图6　不同pH条件下酿酒酵母发酵过程中的单日质量损失Fig.6 Daily mass loss ofSaccharomyces cerevisiaeunder different pH conditions

图6为不同pH条件下，菌株A、B、F在MSM培养基中相应的CO2释放量。由图6可以看出，不同pH条件下酿酒酵母的发酵速度和单日最大质量损失随pH的降低而降低，但不同pH条件下的单日最大质量损失差异较小。pH值为4.0时，酿酒酵母发酵最快，在第8天的单日质量损失即＜0.1 g。低pH对不同菌株的影响大小不同，A和F菌株受到的影响较大，B菌株受到的影响较小。经过对数据分析可知，3株菌在pH为4.0时，单日质量损失与pH值为3.1、3.4时相应菌株的单日质量损失有显著性差异（P＜0.05），说明pH值为4.0时，A、B、F酿酒酵母发酵速度明显快于pH值3.1、3.4条件下相应酵母的发酵速度。

在酿酒酵母的发酵过程中，随pH值的降低，酵母的生长与发酵情况也逐渐变差，这可能是由酿酒酵母在低pH下的繁殖能力下降［20］和酿酒酵母在较低的pH条件下对CO2的耐受性下降导致的［8，21］。由试验结果可以看出，pH值在4.0的情况下，酵母的生长和发酵情况最好。

3　结论

本实验主要研究了在不同的温度、转速以及pH条件下酿酒酵母（S.cerevisiae）在模拟葡萄汁培养基中的生长和发酵过程。试验结果显示，在18～33℃的温度范围内，随着温度的升高，发酵效率逐渐增大，28℃是最适宜酵母生长的温度。在50～150 r/min的转速范围内，随着转速的增大，酵母的发酵效率逐渐增大，所需发酵时间也逐渐缩短，在150 r/min的转速条件下，3株酵母生长状况良好且发酵效率最高。在葡萄酒酿造常用的pH范围内（3.3～4.0），酿酒酵母的生长和发酵情况随pH的升高而增强，pH值在4.0的情况下，酵母的生长和发酵情况最好。而在本试验中，B菌株受到低pH的影响较小，说明B菌株对低pH条件有一定耐性。本试验作为研究酿酒酵母其他更深入的方面研究的基础，为在葡萄酒酿造相关试验选择条件中提供了的理论依据。

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Research on the factors affectingSaccharomyces cerevisiaefermentation

ZHANG Qianwen，WANG Chunxia，YANG Liyun，HUANG Weidong，ZHAN Jicheng*
（Co11ege of Food Science and Nutritiona1 Engineering，China Agricu1tura1 University，Beijing 100083，China）

The ethano1 fermentation of wine is main1y comp1eted bySaccharomyces cerevisiae.Different cu1ture condition can inf1uence the fermentation efficiency ofS.cerevisiae.In this study，mode1 synthetic medium was used to rep1ace the grape must.The effect of temperature，shaking speed and pH of the medium onS.cerevisiaewas studied.The resu1ts showed that in the 18-33℃temperature range，the fermentation effcieng rose up with the increase of temperature 28℃was the most suitab1e temperature for the growth ofS.cerevisiae.Whi1e in the 50-150 r/min speed range，fermentation efficiency rose up and the period of fermentation shortened with the increase of shaking speed.The 150 r/min was the optima1 shaking speed for S.cerevisiaeto reproduce and ferment.Moreover，in the pH range which was wide1y used in wine making，the growth ofS.cerevisiaeand its fermentation condition increased with the increase of pH，and pH 4 was the optima1 cu1ture condition forS.cerevisiae.

Saccharomyces cerevisiae；temperature；shaking speed；pH；fermentation

TS210.9

A

0254-5071（2015）12-0014-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.004

2015-10-29

国家星火计划项目（2015GA600003）

张倩雯（1991-），女，硕士研究生，研究方向为葡萄与葡萄酒相关微生物。

战吉宬（1972-），男，副教授，博士，研究方向为葡萄栽培与酿造研究。