刘希宇, 贺小英,王凤梅,程 腾, 马利兵*

(1.内蒙古科技大学 数理与生物工程学院，内蒙古 包头 014010；2.包头轻工职业技术学院， 内蒙古 包头 014035)

0 引言

石蒜碱是中草药中具有显著药理活性的重要化学成分，研究发现石蒜碱具有抑制乙酰胆碱酯酶、催吐、镇静、阵痛及抗肿瘤等多种生物活性[1-3]，且对多种癌细胞系以及人类白血病细胞系具有较强的抑制活性[4-6]，Lamoral-Theys 等研究发现石蒜碱主要通过抑制肿瘤细胞生长发挥抗肿瘤作用，且对肿瘤细胞的抑制活性是正常细胞的15倍[7].然而，目前尚未见有关石蒜碱对人胃癌细胞(human gastric cancer cells, hGCCs)影响的报道.基于此，本研究观察与分析了石蒜碱对hGCCs体外增殖的影响.

1 材料与方法

1.1 试剂

EDTA、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购于杭州四季青公司，青霉素、链霉素购于华北制药，石蒜碱购于西安玉泉生物科技有限公司，台盼蓝、胰蛋白酶购于Amresco公司，DMEM高糖培养基购于Gibco公司，凯基AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司，其余试剂均购于sigma公司.

1.2 hGCCs的体外培养及传代

hGCCs来自于本实验室液氮罐冻存.从液氮罐中迅速取出冻存的hGCCs，置于37 ℃水浴锅中3～5 min，至其完全溶解，随后，将细胞冻存液移至离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，随后，以细胞培养液(添加10% FBS的DMEM高糖培养液)洗涤细胞2～3次，接种于100 mm细胞培养皿中，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱(Galaxy S，购于Rs Biotech公司)中进行培养，每2～3 d更换一次培养液.待hGCCs达到80%～90%汇合时，倒掉培养液，用D-PBS洗涤细胞2～3次，采用消化液(添加体积份数0.25%胰蛋白酶和体积份数0.05%EDTA的D-PBS)消化细胞，经细胞培养液洗涤2～3次后，部分细胞冻存备用，部分细胞接种于60 mm培养皿中，其余细胞以1.2×105个/mL的密度接种于96孔培养板中，继续培养.

1.3 石蒜碱处理及细胞计数

向96孔培养板中的不同孔中添加石蒜碱，使其终摩尔浓度分别达到0、1.25、2.50及5.00 μmol/L，每24 h换液一次，并消化不同处理组一个孔中的细胞，经细胞培养液中和及台盼蓝染色后，采用细胞计数板计数死细胞数和活细胞数.不同处理组每次计数均重复4次，每24 h计数1次，连续计数9 d，绘制hGCCs的生长曲线图并利用公式(1)计算细胞活力.

(1)

1.4 石蒜碱处理及流式细胞技术检测

接种于60 mm培养皿中的hGCCs，分别以0、1.25、2.50、5.00 μmol/L浓度的石蒜碱处理48 h，按凯基AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒操作步骤处理各组样品.处理后的样品采用流式细胞仪(BD FACSCanto TM II，购于BD公司)检测处于不同细胞周期的细胞比例.

1.5 数据分析

对细胞计数法统计得出的死细胞数、活细胞数及细胞活力进行数据处理，使用SPSS软件进行单因素方差分析，检验其差异是否显著，当p<0.05表示差异显著.

2 结果与分析

2.1 体外培养的hGCCs形态特征

在倒置显微镜下观察，hGCCs为贴壁依赖型细胞，培养24 h已处于贴壁状态，此时细胞形态为不规则多边形或三角形(见图1 A).随着培养时间延长，细胞逐渐呈上皮样或不规则多边形状，且体积有所变大，继续培养2～4 d后hGCCs在培养皿中排列密集，铺满培养皿底部，部分区域会呈现出层叠生长的现象(图1 B)，表明hGCCs已失去接触抑制性，对其继续进行培养，hGCCs会出现堆砌生长，层叠数可以不断增加.

A. 贴壁后的hGCCs； B. 层叠生长的hGCCs图1 体外培养的hGCCsFig.1 hGCCs cultured in vitro

2.2 石蒜碱处理对hGCCs体外增殖的影响

为了定量研究不同浓度石蒜碱对体外培养的hGCCs生长的抑制作用，采用细胞计数法，对不同处理组、不同处理时间的hGCCs总数进行计数，绘制hGCCs体外增殖曲线图，结果见图2.

图2 不同浓度石蒜碱处理后hGCCs的生长曲线Fig.2 The growth curve of hGCCs after treatment with different concentration of lycorisradiata alkali

由图2可以看出，不同浓度的石蒜碱对hGCCs的体外生长均具有一定的抑制作用，且随着石蒜碱浓度的升高，抑制作用越发明显.

为了进一步探究石蒜碱抑制hGCCs体外增殖的机理，不同浓度石蒜碱处理4～7 d后的hGCCs，经台盼蓝染色后，采用细胞计数法统计死细胞数、活细胞数，并据此计算细胞活力，结果见表1和表2.

表1不同浓度石蒜碱处理后hGCCs死细胞数、活细胞数
Tab.1TheamountoflivingordeadhGCCsaftertreatmentwithdifferentconcentrationoflycorisradiataalkali

注：同一列中上标不同字母表示差异显著

由表1可以看出，不同浓度石蒜碱处理组的活细胞数显著(p<0.05)低于空白对照组的活细胞数，且这种差异随着石蒜碱浓度的增加、培养天数的延长而越发显著；同时，5.00 μmol/L处理组的活细胞数显著(p<0.05)低于1.25 μmol/L 处理组；而处理组与空白对照组在死细胞数上差异不显著.这一结果表明，石蒜碱对hGCCs的主要影响在于其抑制hGCCs的快速增殖，且随着石蒜碱浓度的升高，抑制作用增强.

由表2可以看出，随着石蒜碱浓度的增加及培养时间的延长，hGCCs的细胞活力显著(p<0.05)低于空白对照组的细胞活力，这一结果表明石蒜碱处理会一定程度导致细胞凋亡率上升.

2.3 石蒜碱处理对hGCCs细胞周期的影响

表2不同浓度石蒜碱处理后hGCCs活力
Tab.2ThevitalityofhGCCsaftertreatmentwithdifferentconcentrationoflycorisradiataalkali

注：同一列中上标不同字母表示差异显著

为了探究石蒜碱抑制hGCCs快速增殖的机理，体外培养的hGCCs经不同浓度石蒜碱处理2 d后，经凯基AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒预处理后，经流式细胞技术检测处于不同细胞周期的细胞比例，结果见图3.

(A.空白组；B.1.25 μmol/L处理组，C.2.5 μmol/L处理组，D.5 μmol/L处理组)图3 石蒜碱处理后hGCCs中处于不同细胞周期的细胞比例Fig.3 The proportion of hGCCs in different cell cycles after treatment with different concentration of lycorisradiata alkali

由图3可以看出，经不同浓度石蒜碱处理2 d后的hGCCs，处于不同细胞周期的细胞比例明显不同.随着石蒜碱浓度的升高(分别为0、1.25、2.50、5.00 μmol/L)，二倍体细胞的比例逐渐减低(分别为97.29%、90.14%、85.48%、82.48%)，而四倍体细胞的比例逐渐升高(分别为2.71%、9.86%、14.52%、17.52%).这一结果表明，石蒜碱处理可抑制hGCCs由G2期向M期过渡，从而使细胞阻滞于G2期，最终导致hGCCs的快速增殖受到抑制.

3 讨论

癌症的难以治愈性主要表现在其可以无限繁殖，且不受生长空间的限制，和癌细胞的迁移漂变性[8-9].在控制癌细胞疯狂生长时，一方面要抑制其快速增殖，另一方面要控制其正常调亡.当癌细胞可以控制在正常调亡时，一段时间之后，癌症的病理特征就会减少，从而达到治疗的效果[10-11].石蒜碱作为抑制癌症细胞增殖的药物，主要作用机理是使癌细胞阻滞于G2期，从而导致其快速增殖受到抑制；同时对控制细胞正常凋亡的相关酶类的合成产生影响，从而达到细胞凋亡控制的效果.

本实验采用血球计数板计数法统计了不同浓度石蒜碱处理下的hGCCs细胞总数，并进一步计算出细胞活力，发现石蒜碱处理会抑制hGCCs的体外增殖，且较高浓度处理的hGCCs的活力最低，同时发现石蒜碱处理会一定程度导致细胞凋亡率上升.用流式细胞仪分析经PI染色后的细胞悬液，发现处理hGCCs的培养液中石蒜碱含量越大，hGCCs中二倍体细胞占有量越少，四倍体细胞占有量越多.细胞周期过程中，细胞分裂间期主要是正常的二倍体细胞，为细胞分裂复制DNA和合成蛋白质类酶类物质；分裂期的细胞会表现出短暂的四倍体细胞现象.正常情况下细胞间期时间远长于分裂期，从而使二倍体细胞数量多于四倍体细胞数量.检测结果显示hGCCs在细胞分裂期(M期)停留时间变长，表现hGCCs“四倍体”数目变多，hGCCs周期变长，hGCCs增殖速率随之变慢.