郝晋齐 莫春林

核受体依赖的胆汁酸信号调控硬化肝肝再生的研究

郝晋齐 莫春林

目的 探讨核受体依赖的胆汁酸信号在硬化肝肝再生中的作用。方法 根据实践经验制备60只肝硬化SD大鼠肝部分切除模型，将其平均分为3组（n=20），A组使用普通饲料喂养，B组使用0.2%胆酸饲料喂养，C组使用2%消胆胺饲料喂养，持续喂养5d后，检测比较3组大鼠胆汁分泌速度、肝功能指标、肝细胞有丝分裂指数、肝细胞增殖细胞核抗原和细胞核DNA含量，比较分析3组大鼠肝组织核受体的mRNA表达情况。结果 B组胆汁分泌速度、总胆汁酸含量、血清白蛋白、肝细胞有丝分裂指数、细胞核DNA含量均显著高于A组，C组的上述各项指标显著低于A组和B组，上述差异比较均具有统计学意义（P＜0.05）；B组的肝组织核受体mRNA表达量显著高于A组，C组的肝组织核受体mRNA表达量显著低于A组和B组，差异比较均具有统计学意义（P＜0.05）。结论 核受体依赖的胆汁酸信号对硬化肝肝再生的调控作用非常关键，胆汁酸的增加利于肝组织再生。

核受体依赖；胆汁酸；肝硬化；肝再生

肝癌是致死率较高的恶性肿瘤，仅次于胃癌和食道癌，临床研究指出我国的肝癌患者4/5以上存在肝硬化[1]，为了延长生存周期，患者选择肝切除手术，但术后肝组织的再生能力受阻，肝脏功能代偿问题成为目前研究的临床热点。若代偿良好，患者会逐渐恢复，但如果代偿不佳，肝功能会随之衰竭，最终死亡。如何避免肝切除术后肝组织再生的缺失、促进肝功能恢复，对术后生存有着重要临床意义。肝再生是细胞、基因、信号等众因素作用调控过程，核受体参与编码转录因子的超基因家族，参与生理活动调节[2]。本研究探讨核受体依赖的胆汁酸新号在硬化肝肝再生中的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 动物模型的制备 选用雄性60只SD大鼠，体质量100～180g，平均体质量（152.6±26.8）g，根据实践经验进行动物模型制作，饮用0.03%硫代乙酰胺（thioacetamide,TAA）溶液12周来复制肝硬化模型。肝硬化大鼠肝部分切除术模型制备：肝硬化大鼠8%水合氯醛腹腔麻醉(40μg/g)后，切除大鼠肝左叶。

1.2 实验分组 60只肝硬化部分切除术模型完成后进行数字随机化平均分为3组，3组大鼠的体质量比较无显著差异。A组20只使用普通饲料进行喂养，B组20只使用0.2%胆酸饲料喂养，C组20只使用2%消胆胺饲料喂养，连续喂养5d。

1.3 检测指标及方法 胆汁分泌速度：SD大鼠麻醉后严格无菌条件下实施剖腹术，分离胆总管后用1小聚乙烯导管(22G)插管，收集胆汁30min以测定胆汁分泌的速度。

胆汁酸含量：取一定量肝，80℃烘干后，研磨成粉末。用无水乙醇70℃提取3次，提取液80℃蒸干，用石油醚去除脂肪和中性胆固醇，剩余沉淀用含2% Triton X-100的乙醇溶解，再80℃蒸干，最后用蒸馏水溶解沉淀，此液即为提取的肝胆汁酸溶液。用全自动生化分析仪酶法测定总胆汁酸，以每克肝中含有胆汁酸的微摩尔数表示肝胆汁酸含量(μmol/g)。

肝功能：全自动生化分析仪酶法测定白蛋白和丙氨酸氨基转移酶。

肝细胞有丝分裂指数：病理切片行常规染色，有丝分裂肝细胞在1000个干细胞中的比例。

细胞核DNA含量：将大鼠肝脏组织切片行Feulgen法染色后，应用全自动图像分析仪，随机选择3～4个视野，每张切片测定肝细胞150个左右，定位待测肝细胞核，由电视摄像系统提取数字化的细胞核图像，测定细胞核面积，积分光密度，计算出肝细胞U值(DNA相对含量)，经微机处理后，确定DNA倍型。

核受体mRNA：采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，紫外分光光度法鉴定RNA的量和纯度，以逆转录酶-聚合酶链反应(reverse transcriptasepolymerase chain reaction,RT-PCR)法对mRNA进行半定量分析。

1.4 统计学方法 对本组研究的数据采用SPSS17.0统计软件进行分析。正态计量资料采用“±s”表示；2组正态计量数据的组间比较采用t检验以；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝再生相关指标检测结果 B组胆汁分泌速度、总胆汁酸含量、血清白蛋白、肝细胞有丝分裂指数、细胞核DNA含量均显著高于A组（tB-A=15.7，14.8，10.5，27.3，14.5，P＜0.01），C组的上述各项指标显著低于A组和B组，上述差异比较均具有统计学意义（tC-A=7.2，6.7，7.3，3.2，5.0，P＜0.01；tC-B=31.5，21.6，19.9，29.8，20.9，P＜0.01）。见表1。

表1 3组的肝再生相关指标检测结果（±s，n=20）

表1 3组的肝再生相关指标检测结果（±s，n=20）

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2.2 肝组织核受体mRNA检测结果 B组的肝组织核受体FXR表达量（0.67±0.03）mRNA，显著高于A组（0.53±0.02）mRNA，C组的肝组织核受体表达量（0.45±0.05）mRNA，显著低于A组和B组，差异比较均具有统计学意义（tB-A=17.36,tC-A=6.64，tC-B=16.87，P＜0.01）。

3 讨论

部分肝脏切除后多数患者的肝组织均难以再生，剩余肝叶恢复至原处水平的所占比例较少[3]。肝再生是由细胞、基因、信号分子等多因素相互作用调整的过程，核受体属于转录因子编码的超基因家族，可参与多种生理活动的调节。已有报道指出核受体激动剂对肝有丝分裂原的促进效果良好，胆汁酸是与该类受体关系较为密切的信号分子，可以借此来调节多支生理学通路，从而维持胆汁酸和胆固醇内环境稳定[4]。国外学者研究发现核受体依赖胆汁酸信号是肝再生的重要物质，该受体是核受体超家族一员，胆汁酸水平降低和相关核受体缺失均会对肝再生造成影响[5]。

胆汁酸、肝内脂肪堆积、肝炎病毒等因子均会损伤干细胞，在上述肝损伤因子持续作用，肝细胞被细胞外基质替代，进而发展成肝纤维化，最终成为肝硬化。本次研究选择SD大鼠作为实验材料，根据实践经验对其进行选择性处理，使其转化为肝硬化大鼠，通过科学方法将其分组研究，结果提示喂养胆酸的B组大鼠的各项肝再生指标的检测结果明显好于喂养普通饲料及消胆胺，该组的肝组织核受体FXRmRNA的表达量均显著高于A组和C组(P＜0.01)，C组大鼠的mRNA表达量最低。消胆胺是一种较为强效的降胆固醇药物，它可同肠内胆酸结合，抑制胆汁酸的重吸收，增加其排泄，减少肝脏中的胆酸积累，因此C组胆汁酸分泌速度、总胆汁酸量低于A组、B组(P＜0.01)。研究指出FXR可被胆汁酸激活，对肝脏代谢具有重要作用，FXR可同胆汁酸直接结合，作为受体来调控参与胆汁酸代谢基因表达，从而维持胆汁酸内环境稳定[6-7]。FXR调节胆汁酸的具体过程如下：抑制胆汁酸合成的限速酶胆固醇7α羟化酶基因表达，减少胆汁酸的合成；激活肝细胞膜胆盐输出泵转录，促使胆汁酸向胆小管转运；调节肝脏牛磺酸钠协同转运蛋白表达，减少肝脏对胆汁重吸收；上调回肠胆汁酸结合蛋白转录，增加肠道对胆汁酸重吸收[8]。由此可以分析得出胆汁酸分泌量对肝再生的影响效果显著，对临床治疗肝硬化具有重要的指导价值。FXR在胆汁酸、脂类新陈代谢发挥重要作用，其对肝脏毒性损伤所致肝纤维化提供治疗新思路，如合成FXR配体来活化FXR就可能逆转肝纤维化，缓解肝纤维化症状。

综上所述，核受体依赖的胆汁酸信号对硬化肝肝再生的调控作用非常关键，胆汁酸的增加利于肝组织再生。

[1] 罗时敏，谭卫民，邓伟雄，等.法尼酯X受体在肝硬化大鼠肝切除术后肝再生中的作用[J].中华生物医学工程杂志，2010，16(2):131-135.

[2] 孟强,刘克辛.核受体FXR在肝再生中的作用[J].世界华人消化杂志，2013，21（34）：3767-3774.

[3] Chen WD,Wang YD,Meng Z,et al.Nuclear bile acid receptor FXR in the hepatic regeneration[J].Biochimica et biophysica acta,2011,1812(8)：888-892.

[4] 孙增鹏，彭创，汪新天，等.胆汁酸与肝再生的临床研究进展[J].心理医生杂志，2012,22(10):632-633.

[5] 于昊,崔云甫.FXR促进肝脏再生作用的研究进展[J].世界华人消化杂志,2012，20(23):2173-2177.

[6] Fernández-Barrena MG,Monte MJ,Latasa M,et al.Lack of Abcc3 expression impairs bile-acid induced liver growth and delays hepatic regeneration after partial hepatectomy in mice[J].Journal of Hepatology，2012,56(2)：367-373.

[7] 展翰翔，张太平，赵玉沛.核受体FXR在胆汁代谢相关脏器疾病中的调控机制及研究进展[J].国际外科学杂志,2010,37(11):777-780.

[8] 鲁育民.胆汁酸核受体FXR与肝再生[J].现代医药卫生，2012, 28(23)：3594-3595.

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.6.009

项目资助：佛山市科学技术局（ 201208309）

广东 528100 广东省佛山市三水区人民医院普外科 （郝晋齐莫春林）