薛 军，武雪亮，高晓斌，王立坤，屈 明，郭 飞，张鹏程，杨瑞敏，袁美锦

(河北北方学院附属第一医院 1.血管腺体外科; 2.肝胆外科; 3.超声医学科; 4.护理部, 河北 张家口 075000)



研究论文

结直肠腺癌组织survivin和Ki- 67的表达及其与预后的关系

薛 军1*，武雪亮1，高晓斌2，王立坤3，屈 明1，郭 飞1，张鹏程1，杨瑞敏3，袁美锦4

(河北北方学院附属第一医院 1.血管腺体外科; 2.肝胆外科; 3.超声医学科; 4.护理部, 河北 张家口 075000)

目的探究存活蛋白(survivin)和Ki- 67在结直肠腺癌中的表达及与预后的关系。方法用免疫组化SP法和原位杂交法检测survivin和Ki- 67蛋白在30例正常结直肠组织、60例结直肠腺癌中的表达水平，分析survivin和Ki- 67与病理参数及结直肠癌预后的关系。结果60例结直肠癌组织中survivin和Ki- 67蛋白阳性表达分别为73.34%(44/60)和80.00%(48/60)，显著高于30例癌旁正常组织中的10.00%(3/30)和6.67%(2/30)，(P<0.01)；survivin mRNA在结直肠癌组织、癌旁正常组织中阳性表达分别为76.67%、6.67%；survivin和Ki- 67在结直肠癌组织中的表达呈正相关(P<0.05)。Survivin、Ki- 67的表达与结直肠癌的TNM分期、肠壁侵润深度、淋巴结转移、肝转移和腹腔微转移均呈正相关(P<0.05)。survivin和Ki- 67阳性表达患者1、3和5年生存率较低。survivin、Ki- 67、TNM分期、淋巴结转移、肝转移和腹腔微转移是结肠癌患者预后的独立危险因素。结论Survivin和Ki- 67的异常表达与结直肠腺癌发生、发展及预后密切相关，其有望成为结直肠癌诊疗的新靶点。

结直肠癌；survivin；Ki- 67；免疫组织化学；预后

目前，中国结直肠癌的发病率和病死率呈明显上升趋势，且发病年龄日趋年轻化[1]。研究认为，结直肠癌的发生与癌基因的激活和抑癌基因失活、细胞的凋亡受抑密切相关。Survivin是迄今发现最强的凋亡抑制因子，通过死亡受体、线粒体和内质网途径有效抑制细胞凋亡[2]。本研究应用免疫组化SP法、原位杂交法检测结直肠癌组织和癌旁正常组织中survivin的表达，评估其诊断价值，同时检测反应肿瘤增殖活性的Ki- 67的表达，观察其与临床病理参数间及预后的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2011年7月至2013年7月河北北方学院附属第一医院血管腺体外科手术切除的结直肠癌组织60例和30例癌旁正常组织，癌组织取自癌灶中心处，另取标本残端切缘经病理证实为正常肠组织。全部病例都是原发性肿瘤，且术前未行新辅助放化疗及免疫治疗。其中38例男性, 22例女性, 年龄38～78岁(平均57±2)岁；正常结直肠组织中, 19例男性, 11例女性, 年龄38～78岁(平均56±2)岁，二组一般资料无差异，该实验方案获得我院伦理委员会批准并保持全程跟踪，入选对象均签知情同意书。

1.2 免疫组化.原位杂交试剂和方法

兔抗人单克隆浓缩型survivin抗体(克隆号ab3517 R1-5G3)、Ki- 67单克隆抗体(Abcam公司)、survivin mRNA原位杂交试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，survivin靶基因的mRNA序列为:5′-CCTGGCAGCCCTTTCTCAAGGACCACCGCA-3′；5′-A AGCATTCGTCCGGTTGCGCTTTCCTTTCT-3′；5-AGA AAGTGCGCCGTGCCATCGAGCAGCTGG-3′，按试剂盒说明书操作。

免疫组化方法：标本固定，石蜡包埋，切片厚度为4 μm，HE染色，镜下阅片病理诊断，切片经过80 ℃烤箱烤片30 min，乙醇脱水，灭活内源性过氧化物酶，柠檬酸缓冲液高温高压水化修复；PBS洗3次，加一抗，4 ℃过夜；PBS洗3次，加二抗。室温下使用DAB显色试剂显色，苏木精轻度复染，并用1%的盐酸乙醇分化5 min、流水冲5 min、梯度乙醇脱水(80%、85%、90%、95%、100%)及松节油透明5 min，最后树胶封片。阴性对照为PBS代替一抗。

原位杂交方法：切片厚度4 μm，常规脱蜡、水化；3% H2O2室温孵育15 min，灭活内源性过氧化酶活性，暴露mRNA核酸片段：滴加胃蛋白酶37 ℃消化；预杂交：滴加15μL预杂交液，置恒温箱42 ℃，3 h；再次滴加15 μL杂交液，置恒温箱38 ℃杂交过夜；洗涤；滴加封闭液：37 ℃，30 min。滴加生物素化鼠抗地高辛；滴加SABC；滴加生物素化过氧化物酶；37 ℃，20 min。DAB显色，显色20 min。充分水洗；苏木素复染，二甲苯透明后中性树胶封片。阴性对照为不加探针和RNA酶处理的切片。

1.3 阳性结果的判定标准

结果判定参考Soong等[3]的方法，survivin、Ki- 67分别定位于胞质和细胞核，以黄色或黄褐色颗粒为阳性表达，计算阳性细胞百分数并赋予分值,≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>7 5%为4分；观察着色强度并赋予分值，无着色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，深黄色为3分。两者相乘，0分为(-) ，1～4分为(+) ，5～8分为(++)，9～12分为(+++)，(+)～(+++)均视为阳性。

1.4 统计学分析

应用SPSS17.0统计软件分析，计数资料以百分率表示，两组相比采用χ2检验，相关性分析采用Spearmen检验，多因素预后分析采用回归分析。

2 结果

2.1 Survivin和Ki- 67在结直肠腺癌组织中的表达

Survivin、survivin mRNA在结直肠癌组织中的阳性表达明显高于癌旁正常组织(P<0.05)；Ki- 67在结直肠癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常组织，(P<0.05)；survivin、Ki- 67蛋白表达水平与结直肠癌的TNM分期、肠壁侵润深度、淋巴结转移、肝转移和腹腔微转移呈正相关(P<0.05)，其阳性率在TNMⅠ、Ⅱ期低于Ⅲ、Ⅳ期(P<0.05)(图1,2，表1)。

A.positive expression of survivin in normal colorectal tissues; B.positive expression of survivin in colorectal adenocarcinoma tissues; C.positive expression of Ki- 67 in normal colorectal tissues; D.positive expression of Ki- 67 in colorectal adenocarcinoma tissues

图1 免疫组化检测survivin和Ki- 67 在结直肠正常组织和腺癌组织中的表达

Fig 1 Expressions of survivin and Ki- 67 in colorectal normal tissues and colorectal adenocarcinoma tissues detectedby immunohistochemistry(SP× 400)

A.positive expression of survivin mRNA in normal colorectal tissues; B.positive expression of survivin mRNA in colorectal adenocarcinoma tissues; C.positive expression of Ki- 67 mRNA in normal colorectal tissues; D.positive expression of Ki- 67 mRNA in colorectal adenocarcinoma tissues

图2 原位杂交检测survivin 和Ki- 67 mRNA在结直肠正常组织和腺癌组织中的表达

*P<0.01 compared wtih normal tissues.

2.2 Survivin与Ki- 67蛋白表达的相关性

结直肠癌组织中survivin与Ki- 67蛋白表达呈正相关(r=0.641，P<0.05)，随着survivin蛋白表达增强，Ki- 67蛋白表达率亦增高(表2)。

2.3 结直肠癌患者预后的危险因素分析

Survivin、Ki- 67、TNM分期、淋巴结转移、肝转移和腹腔微转移是结肠癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)(表3)。

表2 结直肠癌组织中survivin和Ki- 67 表达的相关性

*P<0.01 compared with Ki- 67.

表3 Survivin 和Ki- 67 在结直肠癌组织中的表达与相关临床病理指标的关系

*P<0.05,**P<0.01 compared with pathological index.

2.4 Survivin与Ki- 67蛋白表达与患者预后的关系

随着survivin、Ki- 67表达程度增加，中位生存时间缩短，survivin三组比较1、3和5年生存率均有差异(P<0.05)；Ki- 67三组比较1、3和5年生存率有差异(P<0.05)(表4,5)。

表5 Ki- 67蛋白表达对结直肠癌术后生存时间和生存率的影响

3 讨论

Survivin基因定位于17q25，内含142个氨基酸残基，相对分子质量为165 ku，是抗凋亡活性最强的一种癌基因[4]。Survivin蛋白是由单个N端杆状病毒重复序列(baculovirus IAP repeat,BIR)、长的C端alpha螺旋区组成的二聚体结构，其中BIR结构能特异性地结合多种细胞信号蛋白(G蛋白亚单位、Src、Fyn和HA2Ras等)，发挥抑制凋亡作用[5]。Survivin基因结构高度保守，其启动子在正常细胞中基本处于休眠状态，仅在肿瘤细胞中过度表达，且具有周期依赖性，集中于G2/M期，因而除在胚胎期组织、胸腺组织、分泌期子宫内膜组织中微表达外，在乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌等绝大多数恶性肿瘤组织中呈高表达[6]。

Survivin抗凋亡的机制主要有：1)直接抑制凋亡终末效应酶cspase- 3和cspase- 7的活性，2)与周期蛋白激酶CDK4、CDK2相互作用形成survivin-CDK4、survivin-CDK2复合体间接抑制cspase- 3，中断凋亡信号传导，从而抑制细胞凋亡[7]；此外,survivin能够通过与纺锤体微管发生特异性结合反应，使肿瘤细胞逃避细胞周期监测点的监视,致肿瘤细胞异常分裂繁殖[8]。Survivin除抑制细胞凋亡外，还能够在调节肿瘤血管的生成、肿瘤细胞耐药性的产生及肿瘤细胞的浸润、迁徙等过程中发挥重要作用[9]。

Ki- 67抗原属于细胞增殖相关蛋白，在G0期以外的所有细胞周期均有不同程度表达，因而被用于评估乳腺癌、食管癌、结直肠癌、淋巴瘤等多种恶性肿瘤细胞的增殖活性[10]。

本组实验表明survivin蛋白高表达状态可能与结直肠腺癌的发生、浸润、肝转移及淋巴结转移等密切相关，这与报道[11- 12]基本一致，原因可能是survivin的异常表达可使细胞克服G2/M期的凋亡调控点而诱导细胞异常分裂，从而抑制细胞凋亡[13- 14]。结直肠腺癌组织中survivin与Ki- 67的表达呈正相关，均呈升高趋势，提示survivin的过量表达使肿瘤细胞异常增殖，二者协同增加了抗凋亡作用，致肿瘤细胞凋亡缺陷、异常增殖，然而具体机制还需更进一步研究。随着survivin、Ki- 67表达指数的增强，其中位生存期和生存率逐步降低，也说明survivin、Ki- 67在评价结直肠癌患者预后方面有重要参考价值。

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Expression of survivin and Ki- 67in colorectal adenocarcinoma and its clinical significance

XUE Jun1*, WU Xue-liang1, GAO Xiao-bin2, WANG Li-kun3, QU Ming1, GUO Fei1,ZHANG Peng-cheng1, YANG Rui-min3, YUAN Mei-jin4

(1.Dept. of Vascular Gland; 2.Dept. of Hepatobiliary; 3.Dept. of Ultrasound; 4.Dept. of Nursing,the First Affiliated Hospital of Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China)

Objective To investigate the expressions of survivin and Ki- 67 in the colorectal adenocarcinoma and its clinical significance. Methods The expressions of survivin and Ki- 67 in 60 specimens of coloreetal adenocarcinoma tissues and 30 specimens of normal eolorectal tissues were detected using Immunohistochemical SP technique and in situ hybridization. Results The positive expression rates of survivin and Ki- 67 in colorectal adenoeareinoma tissues were 73.34%and 80.00%,respectively,while in normal colorectal tissues they were 10.00% and 6.67%.The difference was significant (P<0.01). The positive expression rates of survivin mRNA in colorectal adenoeareinoma and normal tissues were 10.00% and 6.67%. Expression of survivin was positively related with expression of Ki- 67 in coloreetal adenocarcinoma tissues(P<0.05).Expression level of survivin and Ki- 67 was correlated with the TNM staging,liver metastasis,the depth of tumor invasion,lymph node metastasis,and peritoneal micrometastasis(P<0.05).The patients with positive expression of survivin and Ki- 67 had poor progosis with lower one,three,and five year survival rates.survivin,Ki- 67,the TNM staging,liver metastasis,lymph node metastasis, and peritoneal micrometastasis were independent prognosis factors for coloreetal adenocarcinoma. Conclusions Thethe high expression of survivin and Ki- 67 have a significant correlation with the initiation and progression of colorectal adenocarcinoma, and they may be amolecular-biological indicators in predicting the progress and prognosis of colorectal carcinoma.

colorectal carcinoma; survivin; Ki- 67; immunohistochemistry; progosis

2015- 06- 11

2015- 08- 16

河北北方学院校级重大项目(ZD201310);河北省卫计委医学科学研究重点课题计划(20150058); 河北北方学院创新人才项目(CXRC1325);张家口市科技局指令性计划(1311055D)

1001-6325(2015)11-1526-05

R 735.34

A

*通信作者(corresponding author)：yfywlkwxl@126.com