王小雪，巨晓洁，2，褚良银，2，谢锐，汪伟，刘壮

（1 四川大学化学工程学院，四川成都 610065；2 高分子材料工程国家重点实验室，四川成都 610065）

近几年，包载活性物质的聚合物微颗粒一直备受关注，由于它可以广泛应用于药物送达系统[1-2]、食品[3]、农用化学产品[4-5]等领域，起到维护活性物质的稳定性、控制释放活性物质、减少环境污染等作用。其中，环境刺激响应型智能微颗粒在控制释放和靶向释放等方面具有更明显的优势，可以通过环境温度、pH 值、磁场等因素的改变来实现控制释放过程[6-7]。人体的不同组织器官部位有着不同的pH 值环境，并且在很多病理条件下人体的生理pH值也会发生很大的变化[8]。例如，胃液的pH 值在空腹的状态下是1.2，而在饱腹的状态下会达到5.0[9]。近年来随着经济的发展，人们的饮食习惯改变，情绪和工作压力也持续增加，各年龄段胃溃疡的发生率不断增加，而胃酸紊乱是引起这类疾病的主要原因。酸抑制疗法在近几十年中一直被用来治疗这类疾病。这种治疗方法需要药物在短时间内迅速释放以缓解病人的症状[10]。因此，研发一种能在酸性条件下迅速释放药物的聚合物微颗粒作为药物载体，具有重要的研究意义和应用前景。

壳聚糖作为自然界中唯一存在的聚阳离子型碱性多糖，具有良好的生物活性、生物相容性、体内可降解性等优点，在生物医学和药物控释领域一直都备受关注[11-12]。在之前的工作中，作者发现通过对苯二甲醛与壳聚糖交联形成的Schiff-base 结构具有明显的pH 响应特性[13]。在中性环境中，经对苯二甲醛交联的壳聚糖凝胶具有很好的稳定性，并且能够维持其原有的形状和结构完整。然而，在低pH值的酸性条件下，这种Schiff-base 结构会变得不稳定最终使壳聚糖凝胶分解。因此，通过对苯二甲醛交联形成的壳聚糖微颗粒可以作为胃部突释给药的优良载体。

目前用于制备壳聚糖微颗粒的方法主要有乳化交联法[14]、单凝聚法[15]、复凝聚法[16]、喷雾干燥 法[17-18]等，这些方法大多采用机械搅拌或者超声来制备乳液，使得制备得到的壳聚糖微颗粒存在粒径不可控、单分散性差的问题。粒径不均一将会带来用药效果的重现性不好、药物的生物利用度低、药物靶向性差等诸多问题。随着Shirasu Porous Glass（SPG）膜乳化技术和微流控技术的引入，为制备单分散性好的乳液、微颗粒提供了新的途径。但是，在使用SPG 膜乳化技术制备壳聚糖微颗粒时，需要先对SPG 膜进行复杂的疏水处理；而微流控技术不仅装置制备过程复杂，还较难实现产品的大规模生产[19-20]。近年来，静电喷射技术（electrospraying technology）发展迅速，成为一种简单、高效制备微米及纳米尺度颗粒的新技术[21-22]。该方法设备简单、成本低廉、操作方便，有利于大规模生产；而且制备所得的聚合物颗粒单分散性良好。利用这种技术能够将药物封装在聚合物颗粒材料中，从而提高药物的分散性与稳定性，而且药物的包封率可以达到80%左右[23-25]。

因此，本工作采用静电喷射技术来制备具有良好单分散性的壳聚糖载药微颗粒。该方法是通过高压静电使含有药物的壳聚糖水溶液喷射形成粒径均一的液滴，当液滴进入油相接收液后可以形成单分散性良好的W/O 乳液模板，油相中的对苯二甲醛交联剂扩散进入水相液滴与壳聚糖高分子发生交联反应，最终获得具有酸致溶解特性的壳聚糖微颗粒。研究中，以能够抑制胃酸分泌的西咪替丁为模型药物，考察了交联剂浓度对壳聚糖微颗粒的药物包封率以及载药量的影响，并对微颗粒在酸性条件下的溶解特性以及体外释药行为作了研究。

1 实验部分

1.1 主要实验材料和仪器

壳聚糖（脱乙酰度为85%、Mw= 5000），食品级，济南海得贝海洋生物工程有限公司；对苯二甲醛，化学纯，国药集团化学试剂有限公司；聚甘油蓖麻醇三酯（PGPR 90），丹麦Danisco 公司；西咪替丁，阿达玛斯试剂有限公司；其他所用化学试剂均为分析纯，成都科龙化学试剂有限公司。

FA1104 型电子分析天平（精度为1mg），上海精密科学仪器有限公司；Seven Multi 型pH/电导率/离子综合测试仪，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TGL-16C 型飞鸽离心机，上海安亭科学仪器厂；TS2-60 型注射泵，保定兰格恒流泵有限公司；SS-2534H 型静电纺丝设备，北京永康乐业科技发展有限公司；DM4000 型荧光显微镜，德国Leica；JSM-7500F 型扫描电镜（SEM)，日本电子公司；Prestige-21 型傅里叶红外变换光谱仪（FT-IR），日本岛津公司；UV-1700 型紫外-可见分光光度计（UV-vis），日本岛津公司；TCS SP5 型激光共聚焦显微镜（CLSM），德国Leica。

1.2 壳聚糖载药微颗粒的制备

如图1 所示，静电纺丝设备主要由注射泵、连接有金属针头的注射器、正高压电源（H.V）、接地的磁力搅拌器组成。本研究中制备壳聚糖微颗粒时，是以混有药物的壳聚糖水溶液作为喷射液，甲苯/正己醇的混合溶液（1/1，体积比）作为接收液。制备时，将配好的喷射液装入注射器中，通过注射泵以140µL/h 的流速推动喷射液由金属针头流出，其中注射泵和注射器都垂直放置，在金属针头处施加高压电源使喷射液滴在金属针头下形成喷射，高压电源控制在5～6kV 之间使喷射液形成稳定的单锥喷射（cone-jet mode）即可。装有油相接收液的玻璃培养皿作为接收器放在磁力搅拌器上并置于金属针头的正下方，金属针头与接收液液面之间的距离为5cm。在喷射过程中，接收液需要缓慢地搅拌（300r/min），以避免喷射液滴进入接收液中堆积、合并。

图1 静电喷射实验装置及载药微颗粒制备过程的示意图

壳聚糖水溶液在静电高压的作用下喷射形成单分散性良好的喷射液滴，喷射液滴进入接收液后形成W/O 乳液模板，油相接收液中对苯二甲醛交联剂与水相液滴中的壳聚糖高分子发生交联反应。为了确保水相中的壳聚糖高分子交联完全，交联过程持续反应8h，最终制备得到壳聚糖载药微颗粒。将交联好的壳聚糖微颗粒用异丙醇洗去微颗粒表面的油相接收液，然后分散在纯水中。

喷射液和接收液的具体配制过程如下。

称取0.2g 的壳聚糖加入到9mL 纯水中，快速搅拌至完全溶解后加入0.5mL 的二甲基亚砜搅拌混匀；用1mol/L 的NaOH 溶液调节溶液的pH 值至6.3～6.5 之间；离心（8000r/min，20min）去除不溶性杂质，取上清液，加入0.5mL 溶有0.01g 西咪替丁的乙醇溶液搅拌混匀，即作为混有药物的壳聚糖喷射液。

选择甲苯和正己醇的混合溶液作为油相接收液，其在常温下的黏度很小为2.62mPa·s，密度为0.846g/cm-3（小于水的密度），由此可以使喷射液滴到达接收液液面后能够迅速浸没于接收液中形成W/O 乳液模板，避免喷射液滴浮在接收液液面与后面的喷射液滴合并。分别量取正己醇和甲苯以1∶1的体积比混合均匀作为溶剂，加入60g/L 的PGPR 90、0.6%（体积比）的四甲基乙二胺和2.0%的对苯二甲醛，搅拌至完全溶解，即作为油相接收液。其中，对苯二甲醛为交联剂；PGPR 90 为油溶性表面活性剂，可使所得W/O 乳液稳定；四甲基乙二胺为碱性试剂，可以通过加快交联反应的速度来避免乳液的絮凝与合并。

1.3 壳聚糖微颗粒的形貌及化学结构表征

采用荧光显微镜观察分散在油相溶液中的壳聚糖微颗粒的形貌；采用SEM 观察干态壳聚糖微颗粒的形貌。

采用FT-IR 分别对壳聚糖空白微颗粒、西咪替丁药物、包载有西咪替丁药物的壳聚糖微颗粒的化学结构进行表征，样品采用溴化钾压片法制备。

1.4 壳聚糖载药微颗粒包封率及载药量的测定

用pH = 2、37℃的盐酸溶液配制具有不同浓度的西咪替丁溶液，用UV-vis 在218nm 处分别测定不同药物溶液的吸光度值，绘制药物浓度与吸光度之间的标准曲线。

准确称取一定量的壳聚糖载药微颗粒，用5mL的盐酸溶液（pH = 2、37℃）将微颗粒溶解，用UV-vis测定该溶液在218nm 处的吸光度值，通过标准曲线计算出药物的含量。

微颗粒药物包封率、载药量的计算公式如式（1）、式（2）所示。

式中，C 为计算得到的西咪替丁浓度，µg/mL；M1为实际加入药物的量，µg；M2为微颗粒的总质量，µg。

1.5 壳聚糖载药微颗粒的酸响应性能的表征

酸致溶解实验是在实验室自制的玻璃凹槽中进行的，首先取少量分散在纯水中（pH = 6.4）的壳聚糖载药微颗粒混悬液，滴加在自制的玻璃凹槽中，使用温控热台作为控温装置，控制其温度为37℃；然后，加入过量的pH = 2、37℃的盐酸溶液（模拟胃液），在CLSM 下拍摄微颗粒的变化过程。

对于控释实验，首先用UV-vis 测定并绘制药物在pH = 6.4、37℃的纯水溶液中的浓度-吸光度标准曲线。然后分别在37℃下pH = 2 的盐酸溶液和pH = 6.4 的纯水环境中对壳聚糖载药微颗粒的释药效果进行对比研究。准确称取10 组壳聚糖载药微颗粒，分别编号为1、2、3、4、5、1′、2′、3′、4′、5′，将1～5 组分别分散在5mL、pH = 2 的盐酸溶液中，1′～5′组分别分散在5mL、pH = 6.4 的纯水中，通过恒温水浴控制各个样品的温度于37℃。在1min 时取1 和1′号样品，过滤后测定其吸光度值，并通过标准曲线计算溶液中药物含量；在5min 时取2 和2′号样品，过滤后测定其吸光度值并计算药物含量；以此类推，分别依次在10min、30min、60min 时取3 和3′、4 和4′、5 和5′号样品，过滤测定其吸光度值并计算药物含量，并进一步计算出累计释药率，具体的计算公式如式（3）所示。

式中，Ci为第i 号样品计算得到的西咪替丁的浓度，µg/mL；Mi为第i 号样品微颗粒的总质量，µg；DL 为微颗粒的载药量。

2 结果与讨论

2.1 壳聚糖载药微颗粒的形貌及化学结构

图2 壳聚糖载药微颗粒的荧光照片及SEM 照片

通过采用静电喷射技术，成功制备出了壳聚糖载药微颗粒。图2 分别为制备得到的壳聚糖载药微 颗粒的荧光显微照片和SEM 照片。可以看出，由于对苯二甲醛与壳聚糖反应形成的Schiff-base 结构使得微颗粒呈现绿色荧光，制备得到的微颗粒具有比较均一的粒径大小和良好的分散性。壳聚糖微颗粒呈现出不规则的形状，这是由于微颗粒表面的凹陷引起的，这种凹陷的形貌在SEM 照片[图2(b)]看得更为清楚。这种凹陷是由于喷射液中的乙醇在喷射过程中挥发引起的[26-27]。在喷射过程中，乙醇会从喷射液滴表面挥发导致喷射液滴表面的壳聚糖浓度高于喷射液滴内部壳聚糖的浓度，从而使喷射液滴形成凹陷，尽管喷射滴表面和内部的壳聚糖存在浓度差但是高分子的扩散速度很慢而且喷射过程时间非常短，使得喷射液滴在进入接收液之前不能恢复成球形，而进入接收液后，接收液中的交联剂会先与喷射液滴表面的壳聚糖发生交联使其凹陷形状固化，最终使壳聚糖微颗粒呈现不规则的形状。

图3 分别为壳聚糖空白微颗粒(a)、西咪替丁药物(b)、壳聚糖载药微颗粒(c)的FT-IR 图谱。从壳聚糖空白微颗粒的 FT-IR 图谱中可以看到，在1050cm-1处有壳聚糖分子中C—O 的伸缩振动吸收峰，在3400cm-1附近有壳聚糖分子中—OH 和未反应的—NH2的伸缩振动峰的重叠；从药物分子的FT-IR 图谱中可以看到，在1640cm-1和2190cm-1有两个比较强的特征吸收峰，分别为药物分子中C=N 和C≡N 的伸缩振动吸收峰；而在壳聚糖载药微颗粒的FT-IR 图谱中，既有壳聚糖分子的特征吸收峰，又有药物分子的特征吸收峰，结果显示药物被成功包封于壳聚糖微颗粒中。

图3 空白微颗粒、药物及载药微颗粒的FT-IR 图谱

2.2 交联程度对壳聚糖载药微颗粒包封率及载药量的影响

交联剂的浓度会影响壳聚糖凝胶网络结构的交联程度[14，19]，即凝胶的致密程度，从而可能会影响壳聚糖微颗粒的包封率和载药量。因此，考察了交联剂对苯二甲醛的浓度对壳聚糖微颗粒的药物包封率及载药量的影响。如图4 所示，分别考察了交联剂质量分数为0.5%、1%、2%时制备得到的壳聚糖载药微颗粒的药物包封率和载药量。本实验中，2%的交联剂质量分数为其在油相接收液中的最大溶解浓度，当交联剂质量分数大于2%时，交联剂在接收液中不能完全溶解而使接收液呈浑浊状态，从而影响微颗粒的制备。

图4 不同交联剂含量制备得到载药微颗粒的包封率及 载药量

这种以对苯二甲醛为交联剂制得的壳聚糖载药微颗粒，对于西咪替丁药物的包封率和载药量与文献中通过喷雾干燥方法、以戊二醛为交联剂制得的壳聚糖载药微球的结果类似[18]。结果表明，交联剂浓度会影响药物的包封率和载药量。由图4(a)可以看出，当交联剂质量分数为0.5%和1%时，制备得到的载药微颗粒的包封率均比较低，分别为51%和54%。而当交联剂质量分数增加到2%时，微颗粒的药物包封率可以达到80%。这是因为，当交联剂浓度较低时，微颗粒的表面结构比较疏松，这就使得 微颗粒包载的药物在油相接收液中搅拌反应8h 以及后续的离心浓缩、洗涤过程中容易泄露出来，从而降低微颗粒的包封率。而当交联剂的浓度增加时，可以形成网络结构比较致密的凝胶微颗粒，得到包封率较高的壳聚糖载药微颗粒。同样的，当交联剂的浓度比较低时，与壳聚糖的反应速度慢，而且形成的凝胶网络结构比较疏松，因此，得到的微颗粒的载药量也比较低，如图4(b)所示，继续增加交联剂的质量分数到2%时，其与壳聚糖的反应速度加快，形成的凝胶微颗粒的网络结构也比较致密，从而能够得到载药量较高的壳聚糖微颗粒。

由此，为了得到包封率和载药量均较高的壳聚糖微颗粒，需要选择合适的交联剂浓度。实验结果表明，最佳交联剂质量分数为2%。

2.3 壳聚糖载药微颗粒的酸响应性能

为了评价所制备得到的壳聚糖载药微颗粒在酸性条件中溶解的能力，对微颗粒在pH = 2、37℃的盐酸溶液中的溶解过程进行了研究，并通过CLSM拍摄了其在酸性溶液中的溶解过程。如图5 所示，当微颗粒的周围环境从纯水溶液改变为pH = 2 的酸性溶液时，微颗粒先迅速溶胀然后在32s 内完全溶解。壳聚糖微颗粒在酸性溶液中先溶胀是因为壳聚糖微颗粒中游离的氨基在酸性条件中质子化使得壳聚糖分子链之间产生静电斥力，而最终壳聚糖微颗粒在酸性介质中完全溶解，是由于壳聚糖与对苯二甲醛反应生成的Schiff-base 结构在酸性介质中的水解作用。以上实验结果显示，制备所得的壳聚糖微颗粒具有在酸性条件下分解的能力，因此，可以被用于胃部酸抑制剂的突释给药系统。

图5 载药微颗粒在酸性条件下溶解的CLSM 截图

为了证明制备得到的壳聚糖载药微颗粒能够在服药过程的中性pH 值环境中保持结构稳定，而在低pH 值酸性条件下能够迅速溶解并释放药物，对比研究了壳聚糖载药微颗粒分别在pH = 2、37℃的盐酸溶液和pH = 6.4、37℃的纯水中的释药效果。图6 所示为壳聚糖载药微颗粒分别在pH = 2、37℃的盐酸溶液和pH = 6.4、37℃的纯水中的释放曲线。由图中可以看出，当壳聚糖载药微颗粒分散在pH = 2、37℃的盐酸溶液中，1min 内即可达到最大的药物释放率，起到快速释放药物的效果。这一酸致突释现象与图5 中壳聚糖微颗粒在pH = 2、37℃的盐酸溶液中迅速溶解的现象一致，当微颗粒环境改变为pH = 2 的酸性溶液时，微颗粒可以在32s 内完全溶解。与之相反，当壳聚糖载药微颗粒分散在pH = 6.4、37℃的纯水中时，药物释放率在10min 内仅有少量释放，这主要是由分布在微颗粒表面的药物扩散到纯水环境中引起的。随后，微颗粒在纯水中的释药率趋于平缓，在1h 内释药率仅为12.5%，说明包封于微颗粒内部的药物在服药过程的中性pH 值环境中不会大量泄漏。

图6 载药微颗粒分别在pH = 2、pH = 6.4，37℃的环境中药物的累计释放率

3 结 论

（1）利用静电喷射技术，以西咪替丁作为模型药物，以含有药物的壳聚糖水溶液为喷射液，甲苯/正己醇的混合溶液为接收液，成功制备得到单分散性良好的壳聚糖载药微颗粒。

（2）交联剂对苯二甲醛的含量能够影响壳聚糖载药微颗粒的药物包封率和载药量，当交联剂浓度为2%时，壳聚糖微颗粒的包封率及载药量最大，分别为80%和3.8%。

（3）以对苯二甲醛为交联剂制备得到的壳聚糖微颗粒，在中性条件下能够保持结构完整，而在酸性条件下由于Schiff-base 结构的不稳定性致使微颗粒迅速溶解。

（4）体外释药结果表明，制备得到的壳聚糖载药微颗粒在pH = 2、37℃的模拟胃酸溶液中，1min内即可达到最大的释药效果，具有明显的酸致突释给药特性。

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