孙兆远，侯会绒，陈晓东，王丽华（.江苏食品药品职业技术学院食品与营养工程学院，江苏淮安3003；.淮安快鹿牛奶有限公司，江苏淮安3003）

超高压条件对鲜切莲藕杀菌效果的影响

孙兆远1，侯会绒1，陈晓东2，王丽华2
（1.江苏食品药品职业技术学院食品与营养工程学院，江苏淮安223003；2.淮安快鹿牛奶有限公司，江苏淮安223003）

摘要：以鄂莲四号莲藕为试材，采用超高压技术对鲜切莲藕进行杀菌，探讨了超高压压力、保压时间、加压温度、溶液pH等因素对鲜切莲藕中菌落总数和微生物残活率的影响。通过单因素和正交试验确定了超高压杀菌最优条件为：压力400MPa、保压时间25min、加压温度50℃、溶液pH 4.5，在此条件下，鲜切莲藕中的菌落总数为60.3 cfu/g。

关键词：鲜切莲藕；超高压；杀菌

鲜切果蔬制品是指新鲜的果蔬经清洗、整修、去皮、切分、护色、包装等处理，供消费者立即食用或餐饮业使用的一种新式加工产品，因其自然、新鲜、卫生和方便等特点而深受消费者的喜爱[1]。尽管传统的高温热力杀菌方式技术成熟，设备先进，但长时间的高温加热，不可避免地对食品的风味、色泽、质构、营养产生较大的负面影响，而鲜切果蔬制品对感官性状和质构特性的需求，决定了不能采用热力杀菌技术进行处理。超高压（Ultra-high pressure processing，UHP）杀菌是指将密封于耐高压弹性容器内的食品置于以水或其他流体为传压介质的压力系统中，经100MPa～1 000MPa高静压力处理，在较低温度下达到杀菌、灭酶或改善食品功能特性等效果的食品加工方法[2]。不同于一般的热杀菌方法，超高压杀菌时压力仅作用于对生物大分子立体结构有贡献的次级键（如氢键、离子键、疏水作用等非共价键），而对形成蛋白质、淀粉等高分子物质以及维生素、色素和风味物质等低分子物质的共价键没有破坏作用或只有轻微的影响[3-4]。该技术不但能引起食品原料及所含微生物主要酶系的失活，杀死病原微生物，延长食品的货架期，还能更好地保持食品原有的生物特性、风味及营养成分，非常适合鲜切莲藕制品的加工与生产。

超高压对微生物的致死效应不仅与压力大小、保压时间、加压方式、协同温度、介质性质有关，还受到微生物种类、食品组织状态和组成成分等因素的影响[5]，为取得较好的杀菌效果，需根据不同的食品对象选择不同的处理条件。虽然近年来有关超高压对肉制品、乳制品、果蔬汁制品、水产品杀菌效果和品质影响的研究报道较多，但对鲜切莲藕杀菌效果影响的研究鲜有报道。为了探索超高压杀菌技术在莲藕深加工中的应用，提高莲藕附加值，本文利用超高压对鲜切莲藕进行杀菌处理，以菌落总数和微生物残活率为指标，探讨超高压压力、加压温度、加压时间和溶液pH等因素对鲜切莲藕杀菌效果的影响，并通过正交试验对杀菌条件进行了优化，旨在推动超高压技术在鲜切蔬菜中的应用，以期为莲藕新型加工方法的应用提供理论和技术参考。

1　材料与方法

1.1试验材料

鄂莲四号莲藕（NelumbonuciferaGaertn Elian No. 4）：淮安中天生物工程有限公司提供，10月底采收，置于4℃冷库中备用；柠檬酸、氯化钠（分析纯）、营养琼脂培养基（生化试剂）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2试验仪器

HPP600-3超高压处理装置（工作压力0MPa～600MPa，设备功率3 kW～5 kW，有效容积3 L）：包头科发高新技术食品机械公司；DS-1电动组织捣碎机：上海精科实业有限公司；BPC-250F智能生化培养箱：上海俊晟生物科技有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；LDZX-50KBS全自动高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械有限公司；SJY-1000真空包装机：成都洛克鑫机电有限公司；PHS-3C酸度计：上海仪电科学仪器股份有限公司；JA1003A电子精密天平：上海伦捷机电仪表有限公司。

1.3方法

1.3.1样品处理

挑选藕节均完好，藕身较粗，色泽乳白，无异色，无斑点，无机械伤害的莲藕，洗净淤泥，去藕蒂和皮，清水洗净后切分为4mm～5mm的薄片，与50mL一定pH的浸泡溶液一起装入聚乙烯塑料袋中（5片/袋，单片平铺，不叠加），真空包装后立即进行超高压灭酶处理。

1.3.2超高压处理

将1.3.1获得的莲藕浸泡于高压系统传压介质油（葵二酸二辛酯液压油）中，固定升压速率50MPa/s，卸压速度100MPa/s，在设定的压力和温度下加压一段时间后取出，置于冰浴中冷藏，并尽快完成各项指标检测。

1.3.3菌落总数测定

依据GB4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》方法进行检测。

1.3.4微生物残活率计算

杀菌效果采用微生物残活率进行评价[6]，微生物残活率计算公式如下：

lg S=lg（N/N0）

式中：S为微生物残活率；N0为超高压处理前样品中微生物数量，cfu/g；N为超高压处理后样品中微生物数量，cfu/g；lg S为处理前后菌落总数降低的对数值。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1压力对杀菌效果的影响

取浸泡溶液pH为4.5的鲜切莲藕，在加压温度30℃、保压时间15min条件下，分别调整设备压力为100、200、300、400、500、600MPa，按照1.3.2、1.3.3进行杀菌试验和指标检测，以菌落总数和微生物残活率为指标考察超高压压力对杀菌效果的影响，试验结果见图1。

图1　压力大小对微生物杀菌效果的影响Fig.1　Effectofdifferent pressure on them icrobial inactivation of fresh-cut lotus

由图1可知，虽然在鲜切莲藕制备过程中进行了严格的卫生处理，但未经过加压处理的鲜切莲藕初始菌落总数仍然很高（1.5×104cfu/g）。当压力增加到100MPa时，菌落总数迅速降为6.1×103cfu/g，残活率仅为未加压前的40.60%（lg S=-0.391 5）。这主要是因为当超高压使得食品物料原有的常压平衡系统破坏后，组成物料的分子和细胞会通过减小相互距离的方式来建立新的平衡系统[7]。在新平衡系统建立过程中，微生物细胞会发生诸如外形变长、细胞壁变厚、胞壁脱离、细胞表面褶皱或分节，磷脂分子横切面积缩小，细胞膜双层结构收缩等现象[8]，当压力过大时会造成细胞膜机械性断裂，细胞膜结构完全被破坏，胞内核酸和蛋白质渗出细胞，最终导致微生物死亡[9-10]；同时，超高压使蛋白质高级结构中的氢键、离子键、疏水键体积缩小，甚至被切断，从而引起其活性中心结构和立体构象的崩溃，造成酶蛋白发生不可逆性变性，进一步造成酶系统的破坏和生物体生命活动的停止[11]；研究还表明，超高压能使细胞膜上的磷脂由液晶态转变为晶态，从而导致细胞膜流动性降低，细胞膜通透性增加，致使氨基酸摄取和ATP合成受阻，微生物代谢紊乱，这也加速了细胞的破坏和凋亡[12]；此外，超高压还能通过改变次级键间距的方式对DNA立体结构进行破坏，进一步降低DNA的稳定性，影响微生物DNA复制和转录[13]。

随着压力的增加，菌落总数先快速下降，并在300 MPa时达到580 cfu/g，残活率仅为未加压前的3.87%（lg S=-1.412 7）；当压力大于400MPa后，菌落总数随着压力的增加缓慢下降，并在500MPa时达到商业无菌状态（小于100 cfu/m L）；但是即使加压至600MPa，细菌仍然存活（菌落总数=85 cfu/g），且与500MPa压力下的菌落总数（91 cfu/g）差别很小，差异并不明显。这主要是因为每种微生物都有特定的耐压阈值。对压力敏感的微生物耐压阈值相对较低，而耐压菌阈值较高[6]。当实际受压压力小于阈值时，微生物细胞虽然发生形变和皱缩，但是不会引起细胞死亡。只有当压力超过耐压阈值时，微生物才会出现诸如细胞膜完整性被破坏、细胞内含物泄漏、胞浆蛋白凝固、核酸变性等导致微生物死亡的现象[14]。一般来说，真核生物比原核生物对压力更敏感，如酵母菌和霉菌耐压能力远小于细菌，而细菌中革兰氏阴性菌的耐压性小于革兰氏阳性菌。这主要是因为革兰氏阴性菌肽聚糖含量较低（5%～20%），肽聚糖层数较少（1层～2层），细胞壁较薄（10 nm～15 nm），在超高压作用下，易造成细胞壁破裂。而革兰氏阳性菌肽聚糖含量高（50%～80%），肽聚糖层数较多（可达50层），细胞壁较厚（20 nm～80 nm），网络结构紧密，受压时能通过较大幅度的形变来保护细胞壁的完整性[8]。鲜切莲藕样品中菌类多而杂，其中主要优势菌有乳酸菌、肠杆菌、假单胞菌和酵母菌[15]，当压力逐渐增大时，耐压阈值低的酵母菌首先被杀死，随后是对压力敏感的革兰氏阴性菌（肠杆菌、假单胞菌），而少量的革兰氏阳性乳酸菌由于未达到其阈值而存活下来，即使增加保压时间，也不能将其杀死。

2.1.2保压时间对杀菌效果的影响

取浸泡溶液pH为 4.5的鲜切莲藕，在压力400MPa、加压温度30℃条件下，分别调整保压时间为5、10、15、20、25、30min，按照1.3.2、1.3.3进行杀菌试验和指标检测，以菌落总数和微生物残活率为指标考察保压时间对杀菌效果的影响，试验结果见图2。

图2　保压时间对杀菌效果的影响Fig.2　Effectof pressureholding timeon themicrobialinactivation of fresh-cut lotus

由图2可知，在400MPa的高压条件下，菌落总数在短短的5min内由未加压前的1.5×104cfu/g迅速下降为7.6×104cfu/g，残活率仅为未加压前的50.81% （lg S=-0.294 1），而10min后菌落总数则迅速降为1.6×103cfu/g，残活率仅为未加压前的10.67%（lg S=-0.972 0）。这主要是因为超高压处理具有作用均匀、处理时间短、不受食品体积和形状的影响特点[16]。当外部压力作用于不可压缩物体上时，物体中所有原子和分子几乎在同时受到同样的压力 [帕斯卡定律（Pascal'slaw）]。浸泡于溶液中的莲藕就属于不可压缩物体，在外力产生压力增值后，此压力增值瞬时间无损的传至所有原子和分子，莲藕与溶液中的微生物也会在瞬间受到外部压力的破坏；当保压时间为15min时，菌落总数快速下降至156 cfu/g，残活率仅为未加压前的1.04%（lg S=-1.983 0），残活率对数降幅达到最大值（1.011 0）；当保压时间大于15min以后，随着保压时间延长，微生物残活率下降速率明显减弱，并在20 min时达到商业无菌状态（小于100 cfu/mL）；但是即使保压时间延长至30min，细菌仍然存活（菌落总数=65 cfu/g），且与保压25min的菌落总数（91 cfu/g）差别很小。

2.1.3加压温度对杀菌效果的影响

取浸泡溶液pH为4.5的鲜切莲藕，在压力400MPa、保压时间20min条件下，分别调整加压温度为10、20、30、40、50、60℃，按照1.3.2、1.3.3进行杀菌试验和指标检测，以菌落总数和微生物残活率为指标考察加压温度对杀菌效果的影响，试验结果见图3。

图3　加压温度对杀菌效果的影响Fig.3　Effectof tem peratureon them icrobial inactivation of freshcut lotus

由图3可知，在10℃的低温条件下，即使在较高压力下（400MPa）保持20min，菌落总数仍维持在9.54×103cfu/g的较高水平，微生物残活率为未加压前的63.61%（lg S=-0.1965），灭菌效果较差；当温度升高至20℃时，菌落总数下降幅度较大，但残活率对数仅降低0.325 3，杀菌效果仍不理想；当温度升高至30℃时，菌落总数快速下降至580 cfu/g，残活率仅为未加压前的3.87%（lg S=-1.412 7），残活率对数降幅达到最大值（0.890 9）；当温度高于30℃后，菌落总数随着温度的增加缓慢下降，并在50℃时达到商业无菌状态（菌落总数为88 cfu/g）；但试验发现过高的温度（60℃）会使得莲藕表面出现皱缩，硬度增大，脆度变小，影响鲜切莲藕的品质。

温度是影响微生物生长代谢最重要的环境因素，低温或高温均会增强超高压对微生物的杀菌效果[11，14]。这主要是因为低温下易形成冰晶，在微生物因高压产生收缩时给细胞产生更多的机械伤害。但冰晶在杀死微生物的同时也会造成成品感官品质变化大和营养流失等现象，失去了超高压杀菌的意义；高压杀菌时辅助于适当的中温可以使得压力作用放大，不但会减少加压所需的时间和强度，还可以使得杀菌效果大大提高[17]。这主要是因为适当的中温可以导致微生物细胞膜的结构和流动性发生变化，生物大分子的次级键作用减弱，磷脂聚集状态也发生变化，加速了微生物的致死速率[18]。另外，微生物对温度具有极强的敏感性，高温使得微生物体内蛋白质发生变性，与新陈代谢有关的酶类失活，从而影响微生物的生长[8]。

2.1.4溶液pH对杀菌效果的影响

取浸泡溶液pH分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5的鲜切莲藕各3份，在压力400MPa、保压时间20min、加压温度40℃条件下按照1.3.2、1.3.3进行杀菌试验和指标检测，以菌落总数和微生物残活率为指标考察溶液pH对杀菌效果的影响，试验结果见图4。

图4　溶液pH对杀菌效果的影响Fig.4　Effect of pH of solution on them icrobial inactivation of fresh-cut lotus

由图4可知，在压力400MPa、加压温度40℃和保压时间20min的条件下，6种不同pH的鲜切莲藕中菌落总数均小于350 cfu/g（微生物残活率均小于3%），这表明pH在3.0～5.5之间时，均可获得较好的杀菌效果。其中溶液pH为5.5时，菌落总数最大（349 cfu/g），残活率为未加压前的2.33%（lg S=-1.633 3）；当溶液pH降低至4.5时，菌落总数达到商业无菌状态（菌落总数=98 cfu/g），残活率为未加压前的0.65%（lg S=-2.184 9）；当溶液pH低于4.5时，残活率基本维持在0.5%左右，残活率降幅均小于0.05。

pH是影响微生物生长代谢的另一个重要环境因素，每种微生物均有各自最适宜的pH生长需求，远离最适pH时，微生物的生长就会受到抑制甚至是死亡这主要是因为酶、肽或氨基酸等均属于两性电解质低pH环境可改变它们的带电状态，影响酶分子和催化基团间的解离状态，弱化酶分子的各次级键，破坏酶的空间结构[19]；同时，高浓度的氢离子可引起菌体表面蛋白质和核酸水解，并破坏酶类活性[18]；另外，加压后会使得微生物的最适pH范围逐步缩小，这也降低了发生不可逆变性的压力阈值，使得细菌细胞对低pH更加敏感[8]。因绝大多数微生物的最适生长pH都在5～9之间，而本试验选择的pH范围为4.0～5.0，远离了绝大多数微生物的最适生长pH，因此杀菌效果较好。

2.2最佳杀菌条件的确定

在单因素试验的基础上，选择超高压压力、保压时间、加压温度和溶液pH为考察因素，以菌落总数为指标进行L9（34）正交试验，分析各因素对超高压杀菌效果的影响，并确定杀菌最佳工艺条件。因素水平见表1，试验结果见表2。采用极差法对正交试验结果进行分析，并以各因素的水平为横坐标，k值为纵坐标绘制各因素作用的直观分析图（见图5）。

表1　正交试验因素水平表Table1　Factorsand levelsin orthogonalarray design

表2　正交试验结果与极差分析Table2　O rthogonal test resultsand rangeanalysis

续表2　正交试验结果与极差分析Continue table2　Orthogonal test resultsand rangeanalysis

图5　直观分析图Fig.5　In tuitiveanalysisof orthogonal test

由表3可知，RA（63.33）＞RC（58.00）＞RD（55.33）＞RB（16.33），表明四因素对杀菌效果的影响次序为：A＞C＞D＞B，即压力对杀菌效果的影响最大，加压温度次之，保压时间对杀菌效果的影响最小。由表3中各水平对应的K值和直观分析图可以看出，本试验的最佳组合为A2B3C3D2，即超高压最佳杀菌工艺条件为：压力400MPa、保压时间25min、加压温度50℃、溶液pH4.5。

2.3验证试验

按正交试验结果进行3次平行验证试验，结果见表4。

表4　验证试验结果Table4　Verification testof optimalsterilization process

由表4可知，在设定的杀菌条件下，菌落总数结果均小于单因素和正交试验结果，且数值相对稳定，因此确定最佳杀菌条件为：压力大小400MPa、保压时间25min、加压温度50℃、溶液pH 4.5，在此条件下，菌落总数测定结果平均值为60.3 cfu/g。

3　讨论

本文利用超高压技术对鲜切莲藕进行杀菌处理，以菌落总数和微生物残活率为评价指标，探讨了超高压压力、保压时间、加压温度和浸泡溶液pH等因素对鲜切莲藕杀菌效果的影响。经过试验研究和分析得出如下结论：

1）未经过加压处理的鲜切莲藕初始菌落总数很高。

2）随着压力的增加，菌落总数先快速下降后趋于平缓，但即使给予很高的压力也不能将莲藕中所有的微生物杀死。

3）超高压能在5min～10min内迅速杀死绝大部分微生物，但当保压时间大于15 min以后，菌落总数缓慢降低。

4）在10℃～20℃的低温条件下，超高压杀菌效果并不理想；当温度升高至30℃时，菌落总数快速下降；当温度高于30℃后，菌落总数随温度的增加缓慢下降。

5）试验所选6种pH均可获得较好的杀菌效果，当溶液pH降低至4.5时，菌落总数达到商业无菌状态。

6）在单因素的基础上，利用正交试验确定了超高压最佳杀菌工艺条件为：压力大小400MPa、保压时间25min、加压温度50℃、浸泡溶液pH 4.5，在此条件下，菌落总数测定结果平均值为60.3 cfu/g。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.22.005

收稿日期：2015-10-20

基金项目：淮安市2013年度科技支撑计划（工业）项目（HAG2013048）

作者简介：孙兆远（1979—），男（汉），讲师，硕士，主要从事天然产物活性成分的提取与应用研究。

Effectsof Ultra-high Pressure Processing on M icrobial Inactivation of Fresh-cut Lotus

SUN Zhao-yuan1，HOU Hui-rong1，CHENXiao-dong2，WANG Li-hua2
（1.Schoolof Food and Nutrition Engineering，Jiangsu Food&PharmaceuticalScience College，Huaian

223003，Jiangsu，China；2.Huaian Kuailu Milk Co.Ltd.，Huaian 223003，Jiangsu，China）

Abstract：The effects of four reaction parameters，including different pressure，pressure holding time，temperature and pH ofsolution on themicrobial inactivation of fresh-cut lotus（Nelumbo nucifera Gaertn Elian No.4）were investigated by single factorexperimentsand orthogonalexperiment.Results showed that the optimal sterilization process for fresh-cut lotus were as follows：400 MPa，25 min，50℃and pH 4.5.Under these conditions，the totalnumberof colonieswas60.3 cfu/g.

Keywords：fresh-cut lotus；ultra-high pressure；sterilization