樊懿萱，张艳丽，王强，任才芳，王锋



小梅山猪骨髓间充质干细胞基因修饰

樊懿萱，张艳丽，王强，任才芳，王锋

南京农业大学江苏省家畜胚胎工程实验室，江苏南京 210095

樊懿萱, 张艳丽, 王强, 等. 小梅山猪骨髓间充质干细胞Cx43基因修饰. 生物工程学报, 2015, 31(3): 351–360.Fan YX, Zhang YL, Wang Q, et al. Overexpression of connexin 43 in bone marrow mesenchymal stem cells inXiao Meishan swines. Chin J Biotech, 2015, 31(3): 351–360.

通过在小梅山猪骨髓间充质干细胞 (BMSCs) 中过表达缝隙连接蛋白43基因 ()，探究对小梅山猪BMSCs增殖及凋亡的影响，为构建转基因动物模型奠定基础。利用分子技术构建真核表达载体p-，Nucleofector TM法转染P3代BMSCs，检测细胞转染效率，经RT-PCR、免疫荧光和Western blotting鉴定Cx43的表达，流式细胞技术分析BMSCs的增殖能力和凋亡情况。酶切鉴定和测序结果表明，p-真核表达载体构建成功，转染BMSCs后，阳性细胞约占60%。转基因BMSCs中Cx43蛋白表达显著增加，细胞增殖能力显著提高、凋亡率显著下降。结果表明，在小梅山猪BMSCs中过表达不仅能促进细胞增殖而且抑制其凋亡，为下一步在体研究奠定了基础。

基因，小梅山猪，真核表达载体，骨髓间充质干细胞

心脏病是一种严重威胁人类健康的常见病，具有发病率高、死亡率高等特点，全世界每年死于心脏病的人数逐年上升。干细胞移植被视为最有希望攻克这一顽疾的非药物治疗方法。临床和基础研究证实，干细胞移植可以通过生成心肌细胞、旁分泌、促进血管再生、抑制心肌细胞凋亡等机制显著改善心脏功能[1-3]。骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs) 是一群存在于骨髓中、具有不断增殖和自我更新能力的成体干细胞，在一定条件下，可分化为心肌细胞、骨细胞、脂肪细胞及神经胶质细胞等多种细胞类型，且来源丰富，易于获取，在细胞治疗、组织器官移植及基因治疗等方面具有重要的意义[4-6]。但是，干细胞移植治疗心脏病具有潜在的致心律失常作用，其主要原因是心肌细胞缝隙连接的含量、分布及磷酸化/非磷酸化状态出现明显异常，即缝隙连接的重构 (Gap junctions remodeling)[7]。成年哺乳动物心室中缝隙连接主要由缝隙连接蛋白43 (Connexins 43，) 构成，后者介导了心肌细胞间电和化学信号的传递，对心肌细胞生长、分化有重要作用[8]。目前，关于基因的研究主要集中在小鼠等小动物和人类中[9-10]，国内外尚未见对小梅山猪基因的相关报道。

此外，猪不仅是我国最重要的肉用家畜，同时由于其内脏器官的生理功能特征与人类相近，因此更是人类异种器官移植的重要目标动物和理想的人类疾病模型动物[11-12]。小梅山猪是太湖猪的一个著名类型，体型小，身体紧凑细致，具有繁殖力高、适应性强等优点，并且表现出长期近交不衰退的优势，隐性不良基因极少，是十分宝贵的资源，已经被农业部列入我国地方品种保护名录。

鉴于此，本研究以小梅山猪BMSCs为细胞模型，拟克隆获得小梅山猪基因，构建小梅山猪基因真核表达载体，转染小梅山猪BMSCs，观察记录其表达情况、细胞增殖能力和细胞凋亡率等，从而为下一步的在体研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

载体p-C1和小梅山猪BMSCs为江苏省家畜胚胎工程实验室保存。Prime STAR酶、LA酶、pMD19-T载体、T4 DNA连接酶、限制性内切酶Ⅰ、限制性内切酶RⅠ均购自TaKaRa公司；凝胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒购自Axygen公司；无内毒素质粒提取试剂盒购自Omega公司。

细胞基本培养基 (L-DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶、谷氨酰胺、双抗 (青霉素和链霉素)、羊抗鼠β-actin抗体均购自Gibco公司；小鼠单克隆抗体Cx43购自Abcam公司；RNA提取试剂、反转录试剂和荧光定量PCR试剂购自天根生化科技 (北京) 有限公司；转染试剂盒NucleofectorTM购自Lonza公司；引物合成和基因测序由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1基因的扩增

根据猪基因cDNA编码区序列(GenBank登录号：AJ293888.1) 设计引物 (表1)，并在其上下游引物中引入Ⅰ和RⅠ酶切位点。PCR 扩增目的基因片段，PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s，58.8 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.2 pMD-载体构建与测序

PCR 产物经快速回收，其产物 (目的片段)与pMD19-T载体在SloutionⅠ作用下于16 ℃连接2 h，然后转化感受态大肠杆菌DH5α，再将菌液均匀涂布于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB平皿上，37 ℃培养过夜。随机挑取5个大小均匀的白斑菌落，按照质粒抽提试剂盒说明书小量提取质粒，经PCR和Ⅰ/RⅠ双酶切鉴定，将获得的阳性克隆质粒 (命名为pMD-)送公司测序。用NCBI在线工具Blast对所克隆基因序列与目标序列进行同源性比较分析。

1.2.3 pEGFP-真核表达载体的构建

利用Ⅰ和RⅠ限制性内切酶酶切位点，分别对质粒p-C1和pMD-进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳，回收质粒载体和基因片段，T4 DNA连接酶于22 ℃连接4 h，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，经含100 μg/mL氨苄青霉素的LB平皿培养筛选克隆、提取质粒后，用Ⅰ和RⅠ双酶切鉴定，再进行测序。测序正确的菌株于37 ℃扩增，利用无内毒素质粒试剂盒提取表达载体质粒，命名为p-(图1A)，测定其核酸浓度备用。

1.2.4 表达载体转染BMSCs

将小梅山猪BMSCs接种至6孔板中，培养液为含15%胎牛血清，不含青霉素、链霉素的L-DMEM。当细胞汇合达80%−90%时，按照Nucleofector TM转染试剂说明书分别转染重组质粒p-及空载体p-C1。转染24 h后，将培养液换为含15%胎牛血清和青霉素、链霉素各100 U/mL的L-DMEM。转染48 h后，荧光显微镜观察转染情况及细胞形态。并将p-组细胞消化、离心、去上清，PBS重悬，锥虫蓝拒染法计数活细胞比例，最后流式细胞仪检测转染效率。

1.2.5 RT-PCR检测-mRNA的表达

转染48 h后提取各组细胞总RNA，再逆转录成cDNA，加入-引物 (在和连接处设计的引物)，小梅山猪引物作为内参，进行PCR扩增，引物见表1。反应条件：94 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃总延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

表1 载体构建和阳性细胞鉴定所用引物

图1 小梅山猪Cx43基因真核表达载体的构建

1.2.6 免疫荧光检测Cx43表达

接种上述两组细胞于48孔培养板中，待其长满至50%时，弃去上清液，PBS漂洗，加入4%的多聚甲醛，固定15 min；用PBS洗涤后，用含0.25% Triton-X-100的PBS孵育细胞30 min；去除液体，PBS洗涤；使用含1% BSA的PBST孵育30 min；弃去液体，滴加1∶100稀释的Cx43 (小鼠单克隆抗体，Abcam)，在湿盒内 4 ℃过夜；弃去一抗孵育液，PBS冲洗，按1∶200稀释加入Alexa Fluor标记的二抗 (山羊抗小鼠IgG抗体，Invitrogen)，室温下避光孵育1 h；弃去二抗孵育液，避光条件下PBS洗涤后，加DAPI染液孵育1 min，PBS冲洗，倒置显微镜观察、拍照。

1.2.7 Western blotting检测Cx43蛋白表达

分别取两组2×106个细胞加入蛋白裂解液充分裂解，测定蛋白浓度，取等量的蛋白，热变性后进行10% SDS-PAGE。将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，封闭后加入1∶200 Cx43抗体，洗膜，以Duplin标记的二抗 (1∶1 000) 结合，显色，曝光，最后用Odyssey近红外荧光扫描仪扫描胶片。每组随机读取5次灰度分析数据，用Adobe Photoshop软件 (CS 8.0.1) 分析各条带的净光密度值。Cx43蛋白的表达为其与相应的Duplin的光密度值的比值。

1.2.8 生长曲线及细胞周期的测定

取生长状态良好的第3代细胞，按2×104个/mL的细胞密度分别接种于48孔培养板，两组细胞每天各取3个孔进行计数。以细胞数为纵坐标，培养时间为横坐标绘制生长曲线。

取第3代各组细胞，调整细胞密度为5.0×106个/mL，1 500 r/min 离心5 min，弃上清，用PBS洗1次，离心得到细胞团加入1 mL DNA染色液，漩涡混合5−10 s，室温避光孵育30 min，上流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.9 细胞凋亡的测定

取上述两组第3代细胞，待细胞密度达80%左右时，收集细胞并调整其浓度为106个/mL，采用Annexin V/PI染色法流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.10 统计分析

2 结果与分析

2.1 小梅山猪基因cDNA的扩增

扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，显示为单一条带，大小约为376 bp，与预期大小一致 (图1B)。将PCR产物连接到pMD19-T载体上，获得重组质粒pMD-。用Ⅰ和RⅠ对其进行双酶切鉴定，双酶切后片段大小分别为2 692 bp和376 bp，与预期结果相符 (图1C)。

2.2 p-重组质粒的构建与鉴定

重组质粒p-(图1A) 分别经PCR及Ⅰ和RⅠ双酶切，结果表明，所插入的基因大小和方向均正确，利用PCR扩增重组质粒可得到376 bp的特异性目的条带 (图1D)；双酶切后得到4.7 kb和376 bp的条带 (图1E)。测序显示，所构建的p-质粒序列与GenBank中公布的目标序列一致。证明本研究构建的p-重组质粒是成功的。

2.3 质粒转染小梅山猪BMSCs的效率

将验证正确的重组质粒p-转染小梅山猪BMSCs，转染后48 h，在荧光显微镜下可观察到小梅山猪BMSCs表达绿色荧光蛋白，该蛋白在细胞核和细胞质内均有表达，呈高丰度的绿色荧光 (图2A和2B)。流式细胞仪检测EGFP阳性率为 (63.28±8.5)% (图2C)。这也进一步验证了所构建表达载体的正确性。

2.4-在mRNA水平上的表达情况

小梅山猪BMSCs转染48 h 后，采用RT-PCR方法对-基因表达情况的检测结果 (图3) 显示，转染p-后的小梅山猪BMSCs中，能扩增出593 bp的特异性片段，而转空载体p-C1组未扩增出目的片段，说明转染p-之后外源基因可以获得良好的转录。

图2 pEGFP-Cx43质粒转染小梅山猪BMSCs效率检测

图3 小梅山猪BMSCs中E-Cx43 mRNA的检测

2.5 细胞免疫荧光结果

细胞免疫荧光检测可见p-组Cx43蛋白表达阳性，细胞内可见大量红色荧光，而对照组为弱阳性，细胞内仅有少量红色荧光。另外，两组细胞中Cx43蛋白在环核膜的细胞浆位置表达量较高 (图4)。

2.6 Western blotting检测Cx43蛋白表达结果

提取3组细胞蛋白先后以抗β-actin抗体及抗Cx43抗体进行Western blotting检测，可见p-组蛋白条带颜色比BMSCs和p-C1组深 (图5A)，与免疫荧光结果一致，说明转染组中Cx43的表达水平明显增加。灰度分析结果(图5B) 显示，与BMSCs组和p-C1组相比，p-组的蛋白条带灰度值升高，差异有显著性意义 (<0.05)。空载体转染组和BMSCs组之间差异无显著性意义 (>0.05)。

图4 荧光显微镜观察Cx43的表达情况 (400×)

图5 各组的Western blotting和灰度值比较结果

2.7 细胞增殖能力

结果显示两组细胞呈现“潜伏期-对数生长期-停滞期”的生长模式，与对照组细胞相比较，p-组细胞生长速度明显增加(图6A)。

流式细胞仪检测结果表明，转基因小梅山猪BMSCs有25.01%处于S+G2期(细胞增殖期)；对照组细胞有23.07%处于S+G2期，表明转基因的小梅山猪BMSCs分裂增殖能力明显高于对照组 (<0.05；图6B和表2)。

图6 细胞增殖能力和细胞凋亡结果

表2 Cx43基因对BMSCs细胞周期和凋亡的影响

a,b within a column, means without a common superscript differ significantly (<0.05).

2.8 细胞凋亡

用Annexin V/PI染色后通过流式细胞仪检测分析细胞凋亡情况。结果显示，p-质粒转染小梅山猪BMSCs的凋亡率显著低于对照组(<0.05；图6C和表2)。

3 讨论

BMSCs具有贴壁生长的特性，在体外易分离和扩增，免疫源性低，且不存在胚胎干细胞所带来的医学伦理问题，在一定的诱导条件下，这类细胞可定向分化为心肌样细胞等多种细胞类型，还易于外源基因的转入和表达[13]。Orlic等[14]研究发现骨髓细胞移植到梗死心脏中可以缩小梗死面积、改善心脏功能。因此，BMSCs是目前干细胞治疗心脏病研究的一种理想的种子细胞。

基因治疗面临的首要问题是选择何种载体将目的基因导入靶细胞并使其有效表达[15]。用于基因治疗的载体系统可分为病毒性载体和非病毒性载体两类。病毒介导的基因转染由于潜在的致瘤副作用而难于在人体应用；非病毒载体虽转染效率不高，但转染毒性低，从患者安全性角度考虑，更需要致力于非病毒载体介导的基因修饰。其次，选择高效的外源基因导入细胞的方法也是增强基因治疗的方法之一，其分为稳定转染和瞬时转染。研究发现，BMSCs是一种很难转染的细胞，经抗性筛选10 d左右，多数细胞漂浮，贴壁的细胞体积变大，失去成纤维样外形，呈不规则状。且细胞增殖能力降低，不能形成细胞集落，再次消化后存活细胞较少。我们推测其原因为体外培养及药物筛选导致BMSCs老化，增殖能力降低。为此，本研究利用p-C1真核表达载体瞬时转染小梅山猪BMSCs。

尽管大量研究显示干细胞移植可以改善心脏功能，但仍存在诸多问题有待解决，如慢性心衰患者施行干细胞移植治疗后会出现心源性猝死[16]，其原因为移植的干细胞未能与宿主心肌细胞形成有效的电-机械耦连，即缝隙连接没有效地发挥治疗作用[17]。Cx43是哺乳动物心室肌细胞缝隙连接的主要蛋白组分，其介导了心肌细胞间电和化学信号的传递。研究发现，移植敲除基因的骨骼肌成肌细胞至心脏病患者，不能与宿主细胞形成电-机械耦联，移植后大大增加了室速、室颤的发生[18]，而移植过表达的骨骼肌成肌细胞可抑制细胞致心律失常[19]。表明Cx43对维持正常心功能起重要的作用。

本研究发现过表达可促进小梅山猪BMSCs增殖、抑制其凋亡。Waza等[20]发现抑制心肌细胞Cx43蛋白表达可导致细胞凋亡增加，Goubaeva等[21]发现心肌细胞线粒体中存在大量Cx43，对维持线粒体膜完整性、细胞活力及其抗凋亡作用有重要影响。与本研究结果一致。此外，Cx43蛋白仅少量聚集在邻近细胞接触的部位，大多数Cx43表达在BMSCs的环核膜的细胞浆位置，这与Goubaeva等结果相符合[21]。

因此，本研究以p-C1载体为基础构建了带有小梅山猪基因的真核表达载体p-，经限制性内切酶酶切、菌落PCR和DNA测序进行鉴定表明，p-带有的基因片段和GenBank中的序列一致，说明构建成功；并在体外转染BMSCs，通过观察绿色荧光蛋白和RT-PCR证实基因成功转染了小梅山猪BMSCs，通过免疫荧光和Western blotting法检测到蛋白表达明显增加，并通过流式细胞仪分析发现过表达不仅促进了小梅山猪BMSCs细胞增殖而且抑制其凋亡，为下一步移植在体研究奠定了基础。

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(本文责编 郝丽芳)

Overexpression of connexin 43 in bone marrow mesenchymal stem cells inXiao Meishan swines

Yixuan Fan, Yanli Zhang, Qiang Wang, Caifang Ren, and Feng Wang

Jiangsu Livestock Embryo Engineering Laboratory, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China

We studied the function of connexin 43 () gene in Xiao Meishan swine bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) resulting from overexpression.eukaryotic expression vector (p-) was constructed and transfected into BMSCs by nucleofectorTM, after detecting the transfection efficiency; the expression ofwas verified by RT-PCR, immunofluorescence and western blotting. Furthermore, we detected its cell cycle and apoptosis through flow cytometry. Our results show that p-plasmid was successfully constructed, and green fluorescence in p-transfected BMSCs was highly expressed with 60% transfection efficiency. In transgenic Xiao Meishan swines BMSCs, the expression level of Cx43 mRNA and protein were up-regulated. Meanwhile, the ability of cell proliferation was significantly increased, and the apoptosis rate was significantly reduced. Taken together,overexpression could promote the proliferation of Xiao Meishan swine’s BMSCs and markedly reduce their apoptosis, which provides evidence forresearch.

gene, Xiao Meishan swines, eukaryotic expression vector, bone marrow mesenchymal stem cells

June 18, 2014; Accepted:October 31, 2014

Feng Wang. Tel: +86-25-84395381;Fax: +86-25-84395314; E-mail: caeet@njau.edu.cn

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31201802).

国家自然科学基金 (No. 31201802) 资助。