江海强，魏帅帅，吴腊梅，吴 亮，陈盛霞

（1.江阴市中医院检验科，江苏214400；2.江苏大学医学院，江苏镇江212013）

阴道毛滴虫不同引物PCR检测结果比较

江海强1，2，魏帅帅2，吴腊梅2，吴 亮2，陈盛霞2

（1.江阴市中医院检验科，江苏214400；2.江苏大学医学院，江苏镇江212013）

目的 比较使用不同引物进行阴道毛滴虫PCR的检出率。方法 分别应用3对引物（TVK3-TVK7、BTUB9-BTUB2、TV1-TV2）检测72例阴道毛滴虫阳性的阴道分泌物标本，比较其检出率的差异。结果 引物1检出率[68.1%（49/72）]与引物2[86.1%（62/72）]比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；引物1、2与引物3检出率[76.4%（55/72）]比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 引物2具有较高的检出率，引物的选择是影响PCR检出率的重要因素之一。

毛滴虫，阴道； 聚合酶链反应； 阴道

阴道毛滴虫是临床较为常见的一种寄生虫，主要寄生于人体的阴道、尿道和前列腺，主要引起妇女的阴道毛滴虫病。有报道称，阴道毛滴虫感染可以使孕妇胎盘破裂、早产、新生儿体质量过轻的概率增加[1-3]，阴道毛滴虫也可引起男性非淋菌性尿道炎、前列腺炎、不育等疾病，最近有研究结果显示，阴道毛滴虫感染增加人类免疫缺陷病毒感染的机会[4]。阴道毛滴虫病作为一种常见的性传播疾病，严重影响着人类的健康。目前，临床上常规使用的检测方法是生理盐水湿片镜检法，其敏感度较低，Pattullo等[5]对345名妇女的阴道标本用湿片法进行检测，其敏感度为58.5%。

PCR是一种广泛使用的检测技术，目前逐渐被应用于阴道毛滴虫的检测中。Wendel等[6]用PCR检测337例女性的阴道分泌物标本，其敏感度和特异度分别为84%和94%，明显高于湿片镜检法。本文旨在研究使用不同引物进行PCR时，其阴道毛滴虫检出率的差异。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器与试剂 全自动凝胶图像分析系统（美国SynGene公司），SG-20干式恒温仪（金坛市虹盛仪器厂），超低温冰箱（Thermo公司），超净工作台（苏州尚田洁净技术有限公司），梯度PCR仪（德国Eppendorf公司），垂直电泳仪（美国Bio-Rad公司），低温高速离心机（德国Heraeus公司），电子天平（赛多利斯北京有限公司），PCR预混液（美国promega公司），琼脂糖（Speeifieations公司），酚氯仿（南京诺唯赞公司）。

1.1.2 实验标本来源 收集妇科门诊阴道毛滴虫湿片镜检法为阳性的阴道分泌物标本72例，3 000 r/min离心10min，弃去上清液，取其沉渣，保存于-70℃低温冰箱。

1.2 方法

1.2.1 PCR标本的前处理 将保存于-70℃的标本放于室温复融，加入300 μL的1×PBS（pH7.4），颠倒混匀，3 000 r/min，离心10 min，弃其上清液，得细胞沉淀。再次加入300 μL的1×PBS，颠倒混匀，3 000 r/min，离心10 min，弃其上清液，得细胞沉淀。

1.2.2 酚氯仿法提取阴道毛滴虫DNA 步骤如下：（1）在上述处理后的标本中分别加入三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（TE）500 μL、RNAse（10 mg/μL）1 μL、10%十二烷基硫酸钠（SDS）10 μL、蛋白酶 K（20 mg/μL）20 μL，55℃裂解10 min。（2）加入500 μL酚氯仿，颠倒混匀数次，12 000 r/min离心，吸取上层水相400 μL于另一EP管中。（3）向EP管中加入40 μL的3 mol/L醋酸钠和1 000 μL冰无水乙醇，置于-20℃冰箱中20 min，沉淀DNA。（4）用低温高速离心机以4℃最高速离心10min，弃上清液，加入1 000 μL 75%乙醇洗涤。（5）以4℃最高速离心10 min，吸弃可见的乙醇液滴，置于37℃中干燥。（6）待乙醇挥发充分后，将沉淀溶于50 μL的TE中。

1.2.3 PCR引物的设计与合成 根据美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库中阴道毛滴虫标准株基因组的基因序列，在保证开放阅读框正确的前提下，参照文献[7-9]合成3对引物（表1），所有引物与NCBI数据库比对确认正确后，送至上海生物工程有限公司进行合成。

表1 3对引物序列

1.2.4 PCR的反应扩增体系 总反应体系25 μL，包括PCR Green Mix 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1μL，模板DNA 4 μL，灭菌蒸馏水6.5 μL。循环参数：95℃预变性10 min，94℃1 min，（55±5）℃20 s，72℃30 s。设置退火温度为55℃，上下5℃，摸索阴道毛滴虫PCR的最佳退火温度，总共反应35个循环后，72℃延伸10min使反应完全。扩增完成后，取5 μL的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后取出凝胶，将凝胶于凝胶图像分析仪下观察并拍照。同时，选取最佳退火温度对所有标本进行PCR。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件进行数据处理，计数资料以率表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PCR条件的优化结果 梯度PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳后检测10个温度下3对引物扩增效率，结果显示，10个退火温度下均能扩增出单一条带，大小分别为300、120、312 bp，与预期大小一致（图1、2、3）。本研究选取55℃作为最佳退火温度进行后续实验。

图1 引物1梯度PCR结果

图2 引物2梯度PCR结果

图3 引物3梯度PCR结果

2.2 PCR检测阴道毛滴虫结果 3对引物对所有用碱裂解法提取的DNA标本进行PCR，反应结束后用1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果见图4、5、6。

图4 1～12号标本引物1 PCR结果

图5 1～12号标本引物1 PCR结果

图6 1～12号标本引物3 PCR结果

2.3 PCR扩增结果 72例阳性标本中引物1阳性49例，检出率为68.1%；引物2阳性62例，检出率为86.1%；引物3阳性55例，检出率为76.4%。引物1与引物2检出率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；引物1、2与引物3比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨 论

近年来，人们对泌尿生殖系统感染病原体的研究日益深入，阴道毛滴虫作为一种人体常见的寄生虫越来越受到人们的重视。阴道毛滴虫不仅能引起女性阴道炎，还能引起不育和许多围生期并发症。最近有研究显示，阴道毛滴虫感染与人类免疫缺陷病毒感染和宫颈癌的发生有关。

目前，我国临床所使用的阴道毛滴虫检测方法主要是湿片镜检法，该法与培养法相比，其敏感度和特异度都比较低，而且很容易受到标本保存和运输、实验前处理及检验者操作经验等诸多因素的影响，容易引起漏诊和误诊。因此，有学者认为，阴道毛滴虫检测不能以湿片镜检法作为确诊试验[10]。PCR作为一种常用的分子生物学检测方法，已逐渐被用于阴道毛滴虫检测中。

在PCR技术临床运用中，引物的选择是关键因素，其直接关系到检测的灵敏度和特异度。在此次研究中，以酚氯仿法提取的DNA为模板，分别用3对引物扩增，其阳性率分别是68.1%、86.1%和76.4%，引物2 PCR的检出率较高。本实验结果表明，PCR引物的设计直接关系到标本的阳性检出率，所以PCR实验引物的选择优化非常重要。

[1]宋印娥，林昭春．阴道毛滴虫病的流行现状及诊治研究进展[J]．实用医院临床杂志，2010，7（6）：139-141．

[2]van Der Schee C，van Belkum A，Zwijgers L，et al．Improved diagnosis of Trichomonas vaginalis infection by PCR using vaginal swabs and urinespecimenscompared to diagnosis by wet mount microscopy，culture，and fluorescent staining[J].J Clin Microbiol，1999，37（12）：4127-4130.

[3]Cotch MF，Pastorek JG 2nd，Nugent RP，et al.Trichomonas vaginalis associated with low birth weight and preterm delivery.The Vaginal Infections andPrematurity Study Group[J].Sex Transm Dis，1997，24（6）：353-360.

[4]Kissinger P，Adamski A.Trichomoniasis and HIV interactions：a review[J]. Sex Transm Infect，2013，89（6）：426-433.

[5]Pattullo L，Griffeth S，Ding L，et al.Stepwise diagnosis of Trichomonas vaginalis infection in adolescent women[J].J Clin Microbiol，2009，47（1）：59-63.

[6]Wendel KA，Erbelding EJ，Gaydos CA，et al.Trichomonas vaginalis polymerase chain reaction compared with standard diagnostic and therapeutic protocolsfor detection and treatment of vaginal trichomoniasis[J].Clin Infect Dis，2002，35（5）：576-580.

[7]Kengne P，Veas F，Vidal N，et al.Trichomonas vaginalis：repeated DNA target for highly sensitive and specific polymerase chain reactiondiagnosis[J]. Cell Mol Biol：Noisy-le-grand，1994，40（6）：819-831.

[8]Madico G，Quinn TC，Rompalo A，et al.Diagnosis of Trichomonas vaginalis infection by PCR using vaginal swab samples[J].J Clin Microbiol，1998，36（11）：3205-3210.

[9]Mayta H，Gilman RH，Calderon MM，et al.18S ribosomal DNA-based PCR for diagnosis of Trichomonas vaginalis[J].J Clin Microbiol，2000，38（7）：2683-2687.

[10]时祝帅，王德霞，朱进，等.泌尿生殖道中阴道毛滴虫的检测[J].临床皮肤科杂志，2004，33（9）：538-539.

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.22.033

B

1009-5519（2015）22-3448-03

2015-09-06）

江海强（1979-），男，江苏江阴人，硕士研究生，主管技师，主要从事临床检验工作；E-mail：573312027@qq.com。