王少毅，周晓聪

河北大学临床医学院

SD大鼠体外神经元培养技术的简介

王少毅，周晓聪

河北大学临床医学院

目的：寻求一种简单、廉价的原代SD大鼠神经元原代培养方法。方法：采用胰蛋白酶消化法制备游离神经细胞悬液,进行培养。结果：通过多次探索、观察、成功的进行了原代神经元原代培养。结论：本方法适合一般实验室开展SD新生大鼠神经元细胞的培养。

1、材料和方法

1.1 材料

新生SD大鼠（24h以内）；含10%FBS（胚牛血清）的DMEM培养液：0.25%胰蛋白酶；L-多聚赖氨酸；含2%B27（含青链霉素）的neurolbasal培养液；阿糖胞苷浓度为10uM的neurolbasal培养液；75%酒精；D-PBS平衡液；无菌操作器械一套（中号镊子、大剪刀、一把眼科剪、一把小弯镊子、两把小镊子、一把止血钳）、十只5ml离心管、2只50ml离心管、8板细胞培养板（每板6孔）、12块盖玻片、圆形小培养皿、胰蛋白酶滤器、200目细胞滤器、2只5ml注射器、一只移液管、2把移液枪（一把200ul的，另一把1000ul）、污物缸、小烧杯、无菌工作台、水浴箱、细胞培养箱、细胞计数板、光学显微镜、泡沫浮板、冰袋。

1.2 神经元细胞的原代培养方法

1.2.1 取材

取新生24h内的SD大鼠（10只），酒精消毒后，断头处死，在超级工作台中中暴露大脑，剥离脑膜，去除血管，取下0.5mm×1mm× 2mm的大脑皮质组织，置入冰袋上装有DMEM的小培养皿盖中，用小弯镊轻柔捣碎组织，成粥状。

1.2.2 细胞分离与培养

将捣碎的组织放入准备好的胰酶消化管中（10管，每管中约5ml胰酶），盖上盖子，37℃温水浴15分钟（每5分钟翻转一次），使之成云雾状。用一次性无菌塑料吸管吸出消化的组织，放入15mlDMEM培养液中，终止消化，然后用另一支无菌塑料吸管轻柔吹打细胞，大约20次。用5ml注射器吸出组织，经带有筛网的无菌滤器，注入无菌的离心管中，待用。用200ul的移液枪，取一滴细胞，置于细胞计数板上，计数细胞。

1.2.3 接种细胞与细胞纯化

将细胞悬液按每孔1-3毫升移入细胞培养板中，以大约每孔（120-150）×104个细胞的密度种细胞。接种细胞后12h更换培养液，neurolbasal+B27（含青链霉素）培养液1毫升。之后于接种细胞后24h加入含阿糖胞苷的neurolbasal培养液1ml。加入阿糖胞苷后，每48h用neurolbasal+B27（含青链霉素）的培养液半量更换培养基。

1.3 、形态学观察

与每天固定时间，将培养的神经元置于倒置的显微镜下进行观察，注意神经元的生长状况。

1.4 、MTT法测定细胞的存活率

以MTT法测定细胞的存活率,细胞的存活率以正常对照组OD值均数为100%,用公式进行计算：细胞存活率(%)=各孔OD值/正常OD值均数×100。

1.5 、免疫细胞化学鉴定

1.5.1 、取片

神经元培养10d后，弃去培养液，冷4%甲醛1ml固定15min，之后用PBS平衡盐溶液冲洗3遍，取出玻片，晾干后，-20度冷冻备用。

1.5.2 、神经元免疫化学染色步骤

将冷冻的玻片取出，用树胶粘于较大的载玻片上，置于3-8度冷藏15min。之后PBS平衡盐溶液浸泡10min。浸泡完后用PBS液冲洗3遍，吸水纸擦干水份。TritonX-100，加入目标区域，用于提取膜蛋白，驱除非离子性污垢。37℃潮湿环境下，静置15min。PBS液冲洗玻片，再在PBS液中浸泡5min，吸水纸吸干水分。向目标区域加入兔抗鼠的NSE多克隆抗体（一抗，1：100）。37℃，潮湿环境下，静置1h。PBS冲洗两遍，浸泡1min，加入人抗兔NSE多克隆抗体（二抗）。37摄氏度，潮湿环境下静置20min。用PBS冲洗，加入抗二抗，37℃，潮湿环境下，静置30min。PBS冲洗，向目标区域加入DAB显色剂，静置1min后，清水冲洗。HE染色。中性树胶封片。显微镜下观察。

2、结果与分析

2.1 培养神经元的一般观察及鉴定

神经元细胞接刚接种于培养基上时，体积小，透亮，单个均匀分布，未见突起，半悬浮于培养液中。接种6h后有少量细胞开始贴壁,刚贴壁的细胞呈圆形、胞体亮部分呈出芽状;培养24h各孔细胞完成贴壁且大部分细胞伸出三四个突起,长度为10～30μm不等,最长者可达50μm以上,其中有些细胞发生再聚合现象;培养至3d时,神经元突起进一步增多并延长,形成稀疏的网络,培养的神经元细胞以多个突起的锥体细胞为主,胞体呈三角形或椭圆形,体积较大,长径约为8～12μm。其中也有部分2个突起的双极神经元,胞体呈椭圆形,长径为6～8μm。胞体亮、透光性强,周边有光晕,胞浆丰富,核大,核仁隐约可见,突起明显增长。培养至10d时，可见神经元其胞体较非神经元胞体小呈锥体形、卵圆形或梭形,胞体周围光晕明显;核呈圆形较亮,核仁清晰可见;突起细长,有的相互交织成网。而培养的非神经元细胞胞体较大,多呈条带状,突起较粗。神经元位于培养细胞的表层,而非神经元大都位于培养细胞的深层。

2.2 抗有丝分裂剂阿糖胞苷对神经元纯度的影响

加入阿糖胞苷作用24 h,虽使神经元存活率一度降低,但其抑制胶质细胞增殖的作用非常明显。加入阿糖胞苷可使神经元纯度得到明显的提高,提高度可达10%到20%左右。

2.3 鉴定

神经元特异标记NSE免疫荧光检测阳性。

3、结论

采用0.25%胰蛋白酶消化进行培养神经元的分离,以neurolbasal培养基作为培养基质，并在培养第1d，加入神经胶质细胞抑制剂阿糖胞苷，于培养10d后可以收获细胞存活率35%，神经元纯度85%的神经元细胞。希望此方法可以为进行有关神经系统相关问题研究的学者，提供帮助。