黄建龙，王昌建，邓国华，范仲鑫，何世成，朱春霞，唐小明，刘道新*

(1.湖南省动物疫病预防控制中心，湖南 长沙410014；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨150001)

2000年以来，美国多次暴发H6 亚型禽流感，从散养的家禽和商品鸡均分离出了禽流感病毒[1–2]。在中国，H6 亚型是禽流感流行病学调查研究中分离数量最多的亚型之一，占所有禽流感病毒亚型的17.8%[3]。有报道称H6 亚型禽流感病毒不仅可以向H5 亚型高致病性禽流感病毒和H9N2 亚型禽流感病毒提供内部基因片段，而且还可以感染鼠、水貂、猪和人[4–6]，表明H6 亚型禽流感病毒具有跨越种属障碍而感染哺乳动物甚至感染人的潜在危险，因此，加强H6 亚型禽流感病毒的监测和研究具有重要的公共卫生学意义。笔者于2009—2013年对环洞庭湖区活禽批发市场和水禽场进行H6 亚型禽流感监测，分析该地区H6 亚型禽流感的分布和流行趋势，旨在为该地区科学制定H6 亚型禽流感的防控措施，保护人体健康和公共卫生安全提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

Taq DNA 聚合酶、dNTPs 和DNA 分子量Marker 均购自宝生物工程(大连)有限公司；反转录酶、LS TRIzol RNA 提取试剂购自Invitrogen 公司。

1.2 鸡胚

SPF 鸡胚购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

1.3 样品采集

在活禽批发市场上采用随机抽样的方法,于2009—2011年每年的冬季和春季到长沙市杨家山家禽批发市场、长沙市石马家禽批发市场、益阳学门口市场、常德美江市场和岳阳枫桥湖蛋禽批发市场分别抽取10个经营户，每户采10 对咽喉拭子和泄殖腔拭子，共采集2 819 对拭子。

2011—2013年，在水禽场采用多级抽样的方法，通过WinEpiscope 2.0 软件中的Samples–Estimate Percentage 计算(随机抽样；置信水平为90%，可接受误差为7%，预期场群间阳性率为10%)，每次需抽取50个水禽场(群)。根据洞庭湖在湖南的分布特点(分为东洞庭湖、南洞庭湖和西洞庭湖)，每次选取靠近东洞庭湖、南洞庭湖和西洞庭湖各1个县进行取样，每个县每次需要采集15～17个水禽场。再通过 ProMES 软件中的 Detect–Sample Size– Simple Random Sample 计算(随机抽样；置信水平为95%，发生II 类错误的可能性为5%，预期个体阳性率为10%，检测方法的敏感性和特异性都为95%)，如发现1 釆个阳性样品，则需要在每个场 集29 份水禽拭子样品进行检测，同时在每个场抽取10 份环境拭子进行检测。

1.4 病原分离和鉴定

将拭子样品1 000 r/min 离心5min，吸取上清液，以每胚0.2mL 的注射剂量由尿囊腔接种9～10日龄SPF 鸡胚，每个样品接种2～3 枚SPF 鸡胚，37℃孵育，每天观察2次，弃去24 h 内死亡的鸡胚，及时收集孵育24 h 之后死亡的鸡胚，孵育至96 h 时收集所有鸡胚，置于4℃过夜，收获鸡胚尿囊液，用血凝试验(HA)检测是否有禽流感病毒[7]。测定为禽流感阴性(无滴度)的尿囊液再盲传一代。HA 测定为阴性的定为阴性样品。对HA 测定为禽流感阳性(有滴度)的再进行血凝抑制试验(HI)和RT–PCR 检测，以鉴定该病毒是否为H6 亚型禽流感病毒。

1.5 阳性场判定标准

采用国家推荐的RT–PCR 检测方法，将场内至少检出1个H6 亚型禽流感阳性个体的定为阳性场。

1.6 数据统计与分析

试验数据应用Microsoft Excel 软件进行统计分析。

群体阳性率=阳性群体数/采样场数；病毒分离率=病毒分离数/采集的拭子样品数。

2 结果与分析

2.1 活禽批发市场H6亚型禽流感监测及分离情况

2009—2011年，对环洞庭湖区主要活禽批发市场禽流感进行监测，对采集的2 819 对拭子，采用HI 和RT–PCR 鉴定，共分离到183 株H6 亚型禽流感病毒，总的分离率为6.49%。分别在鸡、鸭、鹅拭子中分离到H6 亚型禽流感病毒69、106、8 株，其分离率分别为4.11%、9.58%和23.53%。

在所监测的5家活禽批发市场中都分离出了H6 亚型禽流感病毒，其中长沙市石马家禽批发市场、益阳学门口市场和常德美江市场的H6 亚型禽流感分离率较高，分别为10.17%、8.82%和8.05%，具体情况见表1。

表1 各个活禽批发市场H6 亚型禽流感的分离情况 Table 1 Separation of H6, a subtype AIV in different wholesale markets of live poultry

2.2 洞庭湖区水禽场H6 亚型禽流感检测及分离情况

先后于2011年11月、2012年3月和11月、2013年6月对东洞庭湖、南洞庭湖和西洞庭湖区的水禽场进行禽流感监测的结果表明，在195个水禽场中，有7个水禽场检测到H6 亚型禽流感病毒，群体阳性率为3.6%。在采集的鸭拭子和环境拭子7 311 对中，有13 对鸭拭子和8 对环境拭子分离到H6 亚型禽流感病毒，拭子的病毒分离率为0.29%，具体见表2。

表2 水禽场H6 亚型禽流感的监测情况 Table 2 The detection of H6 in waterfowl field

2.3 洞庭湖区水禽场混合感染情况

在4次持续监测过程中，在7个水禽场检测到H6 亚型禽流感病毒，其中发现1个水禽场为H4 和H6 两种亚型禽流感病毒混合感染。

3 结论与讨论

2009—2011年连续3年都在环洞庭湖区活禽批发市场上分离到H6 亚型禽流感，总的分离率为6.49%，并在所监测的5家活禽批发市场中都有检出H6 禽流感阳性样品，表明在活禽批发市场中家禽隐性带毒H6 亚型禽流感的情况普遍存在。活禽批发市场鸭拭子的H6 亚型禽流感病毒分离率为9.58%，水禽场拭子的H6 亚型病毒分离率为0.29%，表明市场环节水禽H6 亚型禽流感隐性带毒率比养殖环节高。彭宜等[8]的研究显示，在活禽批发市场的鸭中H6 亚型低致病性禽流感占的比例最高，在一定程度上说明禽流感在活禽批发市场存在水平传播的风险，但是市场中的风险因素是什么？是怎么传播的还需进一步研究。这同时也提示我们需要对活禽批发市场中家禽的病原学加强监测，做好市场内车辆等运输工具及市场内环境的消毒工作，提高家禽批发市场的禽流感防控水平，防止禽流感疫情的发生和传播。

水禽特别是家鸭是禽流感病毒的储存库和传染源。由于家鸭经常同时被多个亚型的禽流感病毒混合感染，这为各亚型的基因重组提供了便利。禽流感病毒在水禽与陆禽间传播，可加快表面蛋白的变异，不断丰富内部基因的重配，并加大种间传播的机会[9–10]。张曦等[11]在H6N8 亚型禽流感SPF 鸡感染试验中发现，H6N8 亚型禽流感有能力在水禽和家禽间跨种传播，增加鸭源H6 亚型AIV 在种家禽之间发生重组和传播的机会。笔者对洞庭湖区水禽场H6 亚型禽流感监测的结果显示，水禽场 H6亚型禽流感病毒场间阳性率达到3.6%，拭子的H6亚型病毒分离率为0.29%，说明水禽场H6 亚型禽流感的隐性带毒率较高。在宿主混合感染AIV 的条件下，有可能引起AIV 发生基因突变和重组，改变其生物学特性[12]。笔者在1个鸭场监测到有H4 和H6 两种禽流感病毒混合感染，这提示洞庭湖区的水禽场禽流感基因重组的几率增高，可能加大种间传播的机会，加大禽流感防控的难度。

H6 亚型禽流感病毒主要宿主是野鸟。湖南洞庭湖地区作为“东亚–澳大利亚迁徙线”上候鸟和中国候鸟迁徙主要停歇地，野鸟的迁徙对H6 亚型禽流感的散播起到很大作用[13]。有研究[14]显示，在湖水中禽流感病毒在22℃，4 d 以内或0℃，30 d 以内仍具有感染性，表明禽流感病毒可通过被污染的水在家禽与野禽之间相互传播。笔者在水禽场的环境拭子中也监测到H6 亚型禽流感病毒，因此，要加强洞庭湖区水禽和野鸟的H6 亚型禽流感的监测，并且要做好水禽场环境的消毒工作。

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