吴滟辉，王晓君

(1.湖南农业大学附属医院，湖南 长沙 410128，2.湖南农业大学分析测试中心，湖南 长沙 410128)

致乏蚊虫[1–2]是尖音库蚊的一个亚种，在中国广泛分布于上海、江苏、安徽、河南、陕西、西藏等地区，其幼虫在脏污的水中生长，发育成蛹、蚊。雄蚊吸食花粉、花蜜和植物汁液；雌蚊叮咬人畜，吸食血液，并传播班氏丝虫病、流行性乙型脑炎等疫病，至于能否传播其他疾病，目前尚缺少这方面的研究。为了准确评估致乏蚊虫的公共卫生意义，笔者利用PCR–DGGE技术对致乏库蚊雌成虫的带菌情况进行了分析，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

致乏库蚊采自湖南农业大学校园(经形态学和分子生物学鉴定认定为致乏库蚊)。标本保存于湖南农业大学寄生虫教研室。

1.2 主要试剂与仪器

2×EasyTaq PCR SuperMix、2×TransTaq HiFi SuperMix Ⅰ为北京全式金生物技术有限公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA片段快速纯化/回收试剂盒为北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品；高纯质粒小提试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品；EcoRⅠ、XhoⅠ、pMD18–T、E. coli DH5ɑ为宝生物工程(大连)有限公司产品。扩增引物341f(5′–CCTACGGAGGCAGCAG–3′)、907r(5′–CCC CGTCAATTCATTTGAGTTT–3′)、341fGC(5′–CGCC CGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACG GGGGGCCTACGGAGGCAGCAG–3′)和518r(5′–AT TACCGCGGCTGCTGG–3′)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

主要仪器：变性梯度凝胶电泳仪系统(JY– TD331，北京君意东方电泳设备有限公司产品)； PCR仪(2720 thermal cycler，Applied Biosystems产品)；凝胶成像系统(alphamager®EP，Alpha Innotech产品)。

1.3 方法

1.3.1 DNA 的提取

取致乏库蚊雌成虫3只，于75%乙醇浸泡90 s；用无菌水冲洗，于无菌条件下研磨；加无菌生理盐水500.00 µL，200×g离心1min，取上清液。按试剂盒说明书操作，提取细菌基因组DNA。

1.3.2 16S rDNA V3–V5 区的扩增

以341f和907r为引物扩增16S rDNA V3–V5区。扩增体系50 µL：基因组DNA 5.00 µL，上下游引物(10 µmol/L)各2.00 µL，2×EasyTaq PCR SuperMix 25.00 µL，ddH2O 16.00 µL。……