李依驰，崔看#，程鹏，陈锦，莫旭东，张小波，肖浪涛，夏石头*

(1.湖南省植物激素与生长发育重点实验室，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128)

复制因子C(RFC)是一个最初从人类Hela 细胞提取物中纯化出来、在真核生物中普遍存在的保守基因家族，包括1个大亚基(RFC1)和4个小亚基(RFC2–5)[1–4]。RFC 复合物在DNA 复制和修复、细胞周期检测点控制和多细胞生物发育中起重要作用[5–8]。Xia 等[9–10]在用EMS 筛选更多生物和非生物胁迫的抗性突变体时，发现并鉴定出 rfc3–1 突变体中存在一个由G 到A 的点突变。该点突变导致RFC3 中一个非极性脂肪族氨基酸(Gly–85)变成了带负电的氨基酸(Asp)，从而影响了RFC3 与其他亚基的结合，并导致rfc3–1 植株对病原菌的抗性增强，植株生长发育受到明显影响，株型矮小，花瓣变小、变窄，叶片小而狭长。为进一步研究RFC3 基因突变对叶细胞分裂增殖的影响，建立植物叶片细胞直接高效检测体系，以量化分析rfc3–1 的突变性状，笔者以拟南芥野生型(Col)植株和突变体rfc3–1 植株为材料，采用流式细胞仪对叶片细胞数进行计数，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试材料为拟南芥哥伦比亚生态型野生型植株(Col)和rfc3–1 突变体。

1.2 主要药品与试剂

碘化丙啶(PI)、四盐酸精胺购自Sigma 公司；MES(Methyl Methanesulfonate，甲磺酸甲酯)、纤维素酶(cellulose R10)、离析酶(macerozyme R10)、水合氯醛、甘油和β–巯基乙醇购自鹏程生物有限公司；其他常规化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

叶片酶解液的配制：参照Yoo 等[12]的方法，按比例分别称取纤维素酶、离析酶、KCl 和甘露醇，加去离子水溶解，然后向其中加入预先于70℃预热5min 的MES，于55℃水浴加热10min 以钝化脱氧核糖核酸酶(DNAse)和蛋白酶(proteases)，增加纤维素酶与离析酶的溶解度。……