李辰龙王洪斌孙 心于洪涛

(1.东北农业大学动物医学院,黑龙江哈尔滨 150030; 2.哈药集团生物疫苗有限公司,黑龙江哈尔滨 150040)

鸭病毒性肝炎活疫苗（CH60株）规模化生产工艺改进试验

李辰龙1，2王洪斌1孙 心2于洪涛2

(1.东北农业大学动物医学院,黑龙江哈尔滨 150030; 2.哈药集团生物疫苗有限公司,黑龙江哈尔滨 150040)

在鸭病毒性肝炎活疫苗(CH60株)生产时,用10日龄和11日龄进行病毒增值,同时把病毒稀释倍数由100倍改为5000倍,将鸡胚死亡高峰期、最终死亡率、单胚平均收获单产、病毒含量ELD50进行对比分析,结果表明将病毒进行100倍稀释后,用11日龄鸡胚增值鸭病毒性肝炎弱毒(CH60株)与10日龄鸡胚相比死亡高峰期时间、最终死亡率、病毒含量ELD50、单胚平均收获单产等基本相同;将病毒进行5000倍稀释后,用11日龄鸡胚增值鸭病毒性肝炎弱毒(CH60株)与10日龄鸡胚相比死亡高峰期时间推迟12～24h,最终死亡率基本相同、单胚平均收获单产可提高30%左右、病毒含量ELD50略有上升;采用5000倍稀释病毒,接种11日龄鸡胚的生产工艺可以提高收获单产,降低生产成本,提高产品效价。

鸭病毒性肝炎鸡胚化弱毒(CH60株);稀释倍数;接种日龄

鸭肝炎病毒包含小RNA病毒科、星状病毒科和嗜肝病毒科3个病毒科。嗜肝病毒科的鸭肝炎病毒引起鸭乙型肝炎，其对鸭没有显著的致病性；星状病毒科的鸭肝炎病毒引起Ⅱ型鸭肝炎；小RNA病毒科的鸭肝炎病毒引起Ⅰ型和Ⅱ型鸭肝炎，Ⅱ型鸭肝炎病毒的致病力不如Ⅰ型鸭肝炎病毒，对雏鸭的治病率一般不超过30%。现在流行的鸭肝炎主要是指Ⅰ型鸭肝炎，主要发生于雏鸭，临床表现为发病急、死亡快，是一种具有急性、高度接触性和致死性的传染性疾病，死亡率可高达100%，给养鸭业造成很大危害。

哈药疫苗有限公司用鸭病毒性肝炎鸡胚化弱毒（CH60株）生产的鸭肝炎活疫苗，对预防Ⅰ型鸭肝炎有较好的效果，但在实际生产中用10日龄鸡胚生产时，存在鸡胚死亡时间早，不易收获，单产低的情况。为解决这一实际情况，我们从种毒稀释倍数和接种的鸡胚日龄上，做了很多相关试验，取得了一定的效果。

1 材料

（1）毒种

鸭病毒性肝炎鸡胚化弱毒种（CH60株）由哈药疫苗有限公司质量管理部提供，符合毒种标准，-70℃冰柜保存。

（2）SPF种蛋由哈药疫苗有限公司SPF鸡场提供，符合SPF种蛋标准规定。

2 方法

2.1 分组

将孵化到10日龄和11日龄的SPF的鸡胚，各取400枚，再将10日龄的SPF鸡胚400枚，分为A组和B组，每组分别为200枚；将11日龄的SPF鸡胚400枚，同样分为A组和B组，每组分别为200枚；

2.2 接种

分别将毒种进行100倍和5000倍稀释，然后将100倍稀释的种毒分别接种10日龄和11日龄鸡胚的A组。将5000倍稀释的种毒分别接种10日龄和11日龄鸡胚的B组。每胚均为0.2ml/胚。

2.3 病毒增殖

接种后用蜡封孔，湿度60%，温度37℃静置培养。24h照胚弃掉早死的鸡胚，然后每隔6h照胚一次，将死亡的鸡胚2～8℃保存，到96h将鸡胚全部取出2～8℃保存，活胚弃掉不要，记录鸡胚各时间段死亡情况。将2～8℃保存的鸡胚24h内及时收获，然后一起称重、研磨混匀，留样测ELD50使用。计算鸡胚死亡高峰期、计算最终死亡率、单胚平均收获单产。

2.4 病毒含量测定

将各组测病毒含量ELD50的留样分别用无菌生理盐水进行10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-84个稀释度，每个稀释度各尿囊腔接种发育良好的10日龄SPF鸡胚5枚，0.2ml/胚，然后放在湿度60%，温度37℃，静置培养，24h死胚弃掉，观察96h，记录死亡情况，计算ELD50结果。〔5〕

2.5 相同试验重复3次，进行对比

3 结果与分析

3.1 鸡胚接种后死亡高峰期和最终死亡率

鸭病毒性肝炎鸡胚化弱毒（CH60株），100倍稀释后接种10日龄和11日龄鸡胚与5000倍稀释后接种10日龄的鸡胚比较，死亡高峰期时间、最终死亡率基本相同。但5000倍稀释后接种的11日龄鸡胚，死亡高峰期时间推迟12～24h、最终死亡率与其他3组基本相同。见表1、图1

图1 最终死亡率对比

病毒100倍稀释与5000倍稀释相比，单位体积内病毒数量多了50倍，但病毒对鸡胚的致死能力较强，所以10日龄和11日龄鸡胚最终死亡率基本相同，没有明显差异；

而5000倍稀释后，单位体积内病毒数量变成了1/50，病毒需要繁殖到一定数量，才能致死鸡胚。11日龄鸡胚对病毒的抵抗力较10日龄鸡胚强，所以11日龄鸡胚死亡时间推迟12～24h。

100倍稀释接种11日龄鸡胚与5000倍稀释接种10日龄鸡胚相比，虽然稀释倍数相差50倍，但10日龄鸡胚抵抗力没有11日龄鸡胚强，所以死亡高峰时间和最终死亡率基本相同。

3.2 鸡胚接种后病毒含量和单胚平均收获单产

鸭病毒性肝炎鸡胚化弱毒（CH60株），100倍稀释后接种10日龄和11日龄鸡胚与5000倍稀释后接种10日龄鸡胚比较，病毒含量ELD50基本相同。5000倍稀释后接种11日龄鸡胚，病毒含量ELD50略有提升。

100倍稀释后接种10日龄和11日龄鸡胚单胚平均收获单产基本相同；5000倍稀释后接种11日龄鸡胚，单胚平均收获单产提高近30%。见图2、见图3

表1 鸡胚接种后观察结果、死亡高峰期、最终死亡率对比

图2 平均收获单产对比

图3 病毒含量测定结果对比

100倍稀释后接种10日龄和11日龄鸡胚与5000倍稀释后接种10日龄的鸡胚比较，死亡高峰期时间、最终死亡率基本相同。病毒繁殖的时间基本相同，所以病毒含量ELD50基本相同。而5000倍稀释后，单位体积内病毒数量变成了1/50，病毒需要繁殖到一定数量，才能致死鸡胚，病毒繁殖时间延长，但10日龄鸡胚较弱死亡早，所以接种11日龄鸡胚病毒含量略有提升。

100倍稀释后接种10日龄和11日龄鸡胚与5000倍稀释后接种10日龄的鸡胚比较，死亡高峰期时间、最终死亡率基本相同。所以平均收获单产基本相同。

5000倍稀释接种11日龄，因鸡胚对病毒的抵抗力较10日龄鸡胚较强，死亡时间推迟12～24h，所以鸡胚发育较大，平均收获单产提高30%。见图3

100倍稀释接种11日龄鸡胚与5000倍稀释接种10日龄鸡胚相比，死亡高峰时间和最终死亡率基本相同。所以病毒含量和平均收获单产没有明显差异。但平均收获单产，较100稀释倍接种10日龄鸡胚略高。

4 讨论

（1）病毒100倍稀释后接种10日龄和11日龄鸡胚，5000倍稀释后接种10日龄和11日龄鸡胚，4个组相比，因为病毒本身对鸡胚的致死能力较强，所以最终死亡率基本相同，但11日龄鸡胚对病毒的抵抗力稍强，所以死亡高峰时间推迟12～24h，鸡胚发育时间相对长，病毒繁殖时间要相应长，所以收获单产提高30%左右，病毒含量略有提升。

（2）实验结果表明鸡胚的死亡高峰期，与鸡胚对病毒的抵抗力、接种的病毒数量有直接的关系。10日龄鸡胚与11日龄鸡胚相比抵抗力差，所以减少病毒接种数量，其死亡的高峰期也没有推迟。

（3）10日龄鸡胚无论是100倍接种，还是5000倍接种，死亡时间都很早，鸡胚发育小，再加上病毒对鸡胚的作用，胚体较嫩，收获时容易断，也影响单产。11日龄鸡胚本身多发育24h，胚体较有韧性，5000倍接种后又增加了一定的发育时间，所以收获起来更容易，所以平均收获单产增加较高。

（4）据有关资料介绍鸭肝炎病毒也可以在鸭胚成纤维细胞、鸭胚肝细胞上生长繁殖，今后在规模化生产上可以寻找适合的细胞来培养鸭肝炎病毒来替代鸡胚培养，即可以降低生产成本，又可以减少生物安全方面的风险。

[1] 王勇，李广兴，刘思国.鸭病毒性肝炎的研究进展[J].畜牧兽医科技信息，2007，（3）：7-9.

[2] 殷震，刘景华.动物病毒学（第二版）[M].北京：科学出版社，1997：510-511.

[3] 王明俊.兽医生物制品学[M].北京：中国农业出版社，1997：297-309.

李辰龙，男，兽医师，长期从事兽用生物制品质量检验与生产工作。

王洪斌，男，教授，博士生导师，研究方向：兽医科学专业研究。