刘小玲，李文妍，高甜，郭小彬，杜玉娟，肖云峰,3Δ

(1.内蒙古自治区人民医院 药学处，内蒙古 呼和浩特 010017；2.内蒙古医科大学 新药安全评价研究中心，内蒙古 呼和浩特 010110；3.天津中医药大学 研究生院，天津 南开 300193)



苦参素对大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的研究

刘小玲1，李文妍1，高甜2，郭小彬1，杜玉娟1，肖云峰2,3Δ

(1.内蒙古自治区人民医院 药学处，内蒙古 呼和浩特 010017；2.内蒙古医科大学 新药安全评价研究中心，内蒙古 呼和浩特 010110；3.天津中医药大学 研究生院，天津 南开 300193)

目的 建立大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型，观察其病理学改变；并探讨苦参素对其的影响。方法 取Wistar大鼠30只，随机分为空白对照组、实验性自身免疫性脑脊髓炎模型组(以下简称模型组)和苦参素组。采用EAE症状评分标准对造模后大鼠进行评测，以观察其行为学变化；通过病理学HE染色和Kluver & Barrera髓鞘染色，观察脑和脊髓炎症浸润、血管袖套改变和脊髓脱髓鞘变化。结果 空白对照组动物未见行为学变化和病理学改变。模型组所有动物均出现行为学改变，并伴有髓鞘脱失和不同程度的脑和脊髓炎症浸润。苦参素组6只大鼠未出现EAE行为学变化的临床表现，且髓鞘结构基本完整。结论 苦参素可以延长大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的疾病潜伏期，缓解临床症状并保护神经。

苦参素；实验性自身免疫性脑脊髓炎；病理学；多发性硬化

多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)是一种临床常见的中枢神经系统(central nervous system,CNS) 脱髓鞘疾病。MS主要的发病特点是脱髓鞘病变和CNS炎性反应，是个体遗传易感和环境因素作用发生的一种自身免疫性疾病。

实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型是研究MS最常用的理想实验动物模型[1]。现阶段MS的发病机制尚未明确，因而并没有理想的治疗药物出现。苦参素(oxymatrine)是苦参的主要有效成分，具有调节免疫、升高白细胞和抗病毒作用[2]。近年也有大量实验证实苦参素具有神经保护作用[3]。本研究立足于此，采用豚鼠全脊髓匀浆制备大鼠EAE模型，探讨苦参素对EAE的作用，并观察大鼠行为学变化和CNS的病理学改变，试图为临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:豚鼠，普通级，6 只，雄性，体质量(500±50)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证编号：SCXK(京)2010-0002。

Wistar大鼠，清洁级，30只，雌雄各半，体质量(200±20)g，由内蒙古大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(蒙)2002-0001。

1.1.2 实验试剂及受试物:苦参素注射液(江苏正大天晴药业股份有限公司，批号130419204)；皮内注射用卡介苗(上海生物制品研究所有限责任公司，批号201303012-2)；水合氯醛(天津市北联精细化学品开发有限公司，批号20131220)；完全弗氏佐剂(Sigma，批号9007-81-2)；碘伏(山东利尔康消毒科技有限公司，批号20130807)；生理盐水(山东科伦药业有限公司，批号D131121062)；无水乙醇(天津市化学试剂一厂，批号130706)；二甲苯(沈阳市华东试剂厂，批号121226)；石蜡(上海华灵康复器械厂，批号20130321)；甲醛(天津市风船化学试剂科技有限公司，批号20130408)。

1.1.3 实验仪器：封闭式全自动组织脱水机(Leica，型号ASP200)；切片机(Leica，型号RM2235)；自动染色机(Leica，型号XL)；分体式组织包埋机(Leica，型号EG 1150H)；烘片机、摊片机(Leica，型号HI1210)；荧光倒置显微镜(Leica，型号DM3000)；病理图像分析仪(Leica，型号QWIN)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物环境适应与饲喂：实验动物按等级分环境饲养，大鼠分雌雄饲养于屏障环境中，每盒饲养5只；豚鼠饲养于普通环境中，每笼饲养2只。

实验动物均喂以内蒙古大学实验动物中心提供的标准维持饲料，自由摄水，室温19 ℃～25 ℃，湿度40%～60%。

实验动物适应性饲养1周后，开始试验。

1.2.2 豚鼠全脊髓匀浆(guinea pigs spinal cord homogenate, GPSCH)抗原乳剂的制备[4]：豚鼠称重后，腹腔注射10%的水合氯醛3 mL/kg，麻醉后，固定于解剖板上。备皮、消毒、暴露心脏后，用生理盐水经主动脉灌注预冷的生理盐水至肝脏变白。迅速剥离整条脊柱，无菌除去脊膜，称重后放入无菌匀浆管内，加入等体积预冷的生理盐水，于冰浴中匀浆，制成50%(m/v)的GPSCH。

将该匀浆与含6 mg/mL卡介苗的等体积完全弗氏佐剂一同注入消毒过的玻璃注射器，通过三通连接另一消毒过的玻璃注射器。匀浆液在冰浴条件下反复在2个注射器内抽吸500次，制成稳定的油包水型抗原乳剂。

1.2.3 分组、造模及给药

分组：将30只大鼠随机分为空白对照组、模型组和苦参素组，每组10只。

EAE模型的建立[5]：分别于模型组和苦参素组大鼠双后肢足垫皮内和肩背部皮下各注射抗原乳剂0.2 mL和0.1 mL，空白对照组大鼠双后肢足垫皮内和肩背部皮下注射生理盐水0.2 mL和0.1 mL。

给药：模型组：自免疫当日起，腹腔注射生理盐水6.7 mL/kg，每天1次，连续16d；苦参素组：自免疫当日起，腹腔注射苦参素注射液100 mg/kg(相当于临床等效量)，每天1次，连续16d；空白对照组：自实验当日起，腹腔注射生理盐水6.7 mL/kg，每天1次，连续16d。

1.2.4 临床EAE症状评分：从免疫当天起，每天对大鼠进行称重，上午、下午2次对其精神状况和活动情况等行为学指征进行观察，并进行评分。评分标准采用国际通用的Correar 6分[6]评分法：0分：无明显异常；1分：动物尾部无力；2分：后肢无力；3分：后肢瘫痪；4分：前、后肢均瘫痪；5分：濒死或死亡。将评分达到或超过1分者视为EAE发病大鼠。

1.2.5 病理学检查

取材：大鼠称重后，腹腔注射10%的水合氯醛3 mL/kg，麻醉后，固定于解剖板上。备皮、消毒、暴露心脏后，用生理盐水经主动脉灌注预冷的生理盐水至肝脏变白，迅速取出脑和脊髓。用中性缓冲福尔马林溶液固定48 h，然后放于70 %酒精保存。分别取脑干、小脑、腰膨大及颈髓做石蜡切片，进行HE染色和Kluver&Barrera 髓鞘染色。

病理学评分：参照Yin JX 5分[7]评分标准。0分：无炎症；1分：血管和脊膜周围有炎症浸润；2分：脑或脊髓内部存在轻微炎症浸润(1～10/片) ；3分：脑或脊髓内部存在中度炎症浸润(11～100/片) ；4分：脑或脊髓内部存在重度的炎症浸润(>100/片) 。

2 结果

2.1 临床EAE症状评分 空白对照组平均评分为0分，体重持续增长，未见异常。模型组免疫后第8天出现鼠尾下垂、张力降低等行为学异常现象，潜伏期为(9.42±1.07)d，第14天症状最严重，2只死亡，临床症状评分为(4.84±0.65)分。苦参素组免疫后第13天，相继有4只大鼠出现鼠尾张力降低等现象。苦参素组与模型组比较潜伏期延长，发病率下降，评分降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 苦参素对EAE行为学的影响±s)Tab.1 Influence of EAE behavior by ±s)

*P<0.05，与模型组比较，compared with model group

2.2 炎症细胞改变 通过HE染色，发现空白对照组无炎症浸润等现象。模型组大鼠均有不同程度的多发性炎症浸润，且呈“袖套状”特征，浸润程度最强为脑干。苦参素组较模型组炎症浸润显著减轻，其病灶数和“袖套状”均显著低于模型组，在小脑、脑干和腰髓的炎症浸润细胞显著减轻(P<0.05)。见表2和图1，图1为脑干组织。

表2 苦参素对EAE脑和脊髓炎症浸润的影响±s，分)Tab.2 The influence on EAE inflammatory infiltration of brain and spinal cord by ±s,score)

*P<0.05，与模型组比较，compared with model group

图1 各组炎症细胞改变(HE，×400)Fig.1 Inflammatory cell changes in each group(HE，×400)

2.3 神经髓鞘改变 通过Kluver & Barrera髓鞘染色，发现空白对照组无髓鞘脱失等改变。而模型组均有不同程度的髓鞘脱失，大多与炎症浸润区域伴行。苦参素组髓鞘脱失现象明显弱于模型组，但也存在小片脱失现象。详见图2。

图2 各组神经髓鞘改变(HE，×400)Fig.2 Nerve myelin changes in each group(HE，×400)

3 讨论

苦参素广泛存在于苦参、广豆根等豆科植物中，是氧化苦参碱和极少量其他生物碱的混合物。在一定情况下，氧化苦参碱可以与苦参碱相互转化，抑制自身免疫反应[9-11]。研究表明，苦参素可以降低Bcl-2蛋白的表达，从而抑制CNS炎症细胞浸润[12-13]，因而推测苦参素对EAE有治疗作用。

MS的主要特点是CNS白质脱髓鞘病变，近百年来，临床一直将其作为一种独立的疾病进行治疗。因其高发病率、漫长病程和青壮年易患而受到全世界的重视。临床认为其发病主要与患者自身免疫有关[7]，但是确切的发病机制尚不明确。与此同时，临床一直没有一种完全治愈这种疾病的方法，而使它成为了近些年研究的热门领域之一。EAE模型一直被公认为是MS的经典模型，被用于MS的病因研究[8]。

本研究结果发现，EAE免疫建立后，给予苦参素干预，大鼠出现尾下垂、张力降低等行为学异常现象的潜伏期较模型对照组显著延长(P<0.05)，免疫后第13天，出现行为学异常现象；且发病动物数量显著减少(P<0.05)，苦参素组有4只动物出现了行为学异常现象，EAE症状评分也只有(3.07±0.84)分，与模型组比较有显著性差异(P<0.05)。通过HE染色，发现苦参素组较模型组炎症浸润显著减轻，其病灶数和“袖套状”均显著低于模型组，在小脑、脑干和腰髓的炎症浸润细胞显著减轻(P<0.05)。Kluver & Barrera 髓鞘染色发现苦参素组髓鞘脱失现象明显弱于模型组，但也存在小片脱失现象。由以上结果初步证实，苦参素可以显著降低大鼠EAE的发病率，改善中枢神经系统的炎症浸润，保护神经细胞，并防止髓鞘脱失。

[1] Malte C.Claussen,Thomas Korn.Immune mechanisms of new therapeutic strategies in MS-Teriflunomide[J]. Clinical Immunology,2012,142 (1):49-56.

[2] 高红宁,殷奕. 苦参药材中氧化苦参碱和苦参总黄酮含量的比较研究[J].中药新药与临床药理,2012,23(6):664-667.

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(编校：谭玲)

Study on experimental autoimmune encephalomyelitis with oxymatrine on rats model

LIU Xiao-ling1, LI Wen-yan1, GAO Tian2, GUO Xiao-bin1, DU Yu-juan1, XIAO Yun-feng2,3Δ

(1.Department of Pharmacy, Inner Mongolia People’s Hospital, Hohhot 010017, China; 2.Evaluation Center for New Drug Safety of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, China; 3.Graduate School of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China)

ObjectiveTo establish experimental autoimmune cerebral spinal cord inflammation (EAE) model rats, and observe the pathological changes and effect of oxymatrine on EAE model.Methods30 rats were randomly divided into control group,EAE (model group)group and oxymatrine group.The EAE symptom score was used to evaluate the rats after the model, and to observe the changes of its behavior.By HE staining and Kluver & Barrera myelin dyeing to observe the inflammation of the brain and spinal cord demyelinating changes.ResultsThe animals in control group had no change in behavior and pathological.In model group,all animals occured behavioral changes, accompanied by varying degrees of demyelination and inflammatory infiltration of the brain and spinal cord.In oxymatrine group,6 rats did not appear EAE clinical manifestations and behavioral change, and the myelin structure was intact.ConclusionOxymatrine can extend the incubation period experimental autoimmune encephalomyelitis in rats of the disease, relieve symptoms and protect nerve.

oxymatrine; experimental autoimmune encephalomyelitis; pathology; multiple sclerosis

内蒙古自治区自然科学基金(2012ms1215)；内蒙古自治区卫生和计划生育委员会医疗卫生科技计划项目(201302052)

刘小玲，女，学士，主任药师，硕士生导师，研究方向：临床药理学、药理学,E-mail：nyliuxiaoling@163.com；肖云峰，通讯作者，男，博士在读，助理研究员，研究方向：药理学、毒理学，E-mail：xiaoyunfeng0472@126.com。

R361

A

1005-1678(2015)06-0022-03