李芳芳， 杨少宗， 柳新红， 李海波， 王丽玲， 李永华

(1.河南农业大学，河南 郑州 450002；2.浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023)



枫香树DNA提取及SRAP-PCR反应体系的建立与优化

李芳芳1，2， 杨少宗2， 柳新红2， 李海波2， 王丽玲2， 李永华1

(1.河南农业大学，河南 郑州 450002；2.浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023)

通过不同处理的枫香树叶片及基因组DNA提取方法的对比，并采用L16(45)正交试验设计，对影响SRAP-PCR反应体系的Mg2+，dNTPs，引物浓度及Taq DNA聚合酶和模板DNA用量等5个因素进行优化，确立枫香树SRAP-PCR最佳反应体系。结果表明，改良CTAB法提取枫香树基因组DNA的产率和纯度均可满足下游试验需要。SRAP-PCR最优反应体系为：总体积20 μL，含 1×PCR Buffer，1.5 mmol·L-1Mg2+，0.16 mmol·L-1dNTPs，0.5 μmol·L-1引物，0.9 U Taq DNA聚合酶和40 ng模板DNA。各因素对反应结果的影响大小顺序为Taq DNA聚合酶量>dNTPs浓度>Mg2+浓度>模板DNA用量>引物浓度。运用优化的SRAP-PCR反应体系对10个不同居群的枫香树基因组DNA扩增检测，结果均能获得稳定性高、多态性丰富和重复性好的条带图谱。

枫香树;DNA提取;SRAP-PCR;正交试验设计;反应体系优化

枫香树(LiquidambarformosanaHance.)系金缕梅科(Hamamelidaceae)枫香树属落叶乔木，分布于秦岭淮河以南地区，跨北热带和南、中、北亚热带等4个气候带，是中国重要的乡土阔叶速生树种，集观赏、药用和材用等多种价值于一身。多年来,对枫香树的研究主要集中在无性繁殖技术[1-3]、人工林和混交林技术[4-6]、叶片的叶色分析[7]、种子生物学特性[8, 9]、枫香树林的生理生化研究及园林应用[10]等方面，而对其分子水平的遗传多样性研究较少，目前，仅见枫香树群体细胞学水平的同工酶[11]和特定群体的ISSR分析[12, 13]等。相关序列扩增多态性(Sequence Related Amplified Polymorphism，SRAP) 标记是2001年发展的一种新型分子标记技术[14]，具有简便、快捷、共显性高、重复性好、易于分离条带及测序等优点，已成功用于多种植物，如棉花[15, 16]、桃和油桃[17]、西葫芦[18]、草坪草[19-21]、菊花[22]、一串红[23]、黄瓜[24]及槭属[25]和安息香属[26, 27]等，均显示其可作为遗传多样性评价、品种鉴定、遗传图谱构建和研究系统发生的有效工具[28]。该标记在金缕梅科的研究则未见报道。SRAP标记作为一种有效的分子标记技术，其重要前提条件是研究物种的基因组DNA高质量提取方法及其反应体系的优化和确立。本研究在传统小量法提取植物基因组DNA的CTAB方法基础上加以改良和优化，建立适合枫香树基因组DNA的提取方法：运用正交试验设计，对影响枫香树SRAP-PCR体系的Taq DNA聚合酶，Mg2+，dNTPs，引物和模板DNA用量等5种因素进行优化试验，获得适合枫香树SRAP-PCR反应的最优体系，并对此优化体系进行检测验证，以期为枫香树不同居群的遗传多样性分析、种质鉴定、遗传连锁图谱构建和分子育种等领域研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 分别于2013年9月和2014年3月采集不同居群枫香树生长健壮、无病虫害的幼叶和老叶，置于保鲜袋中，于超低温冰箱中保存备用。

1.1.2 试剂设备 为Taq DNA聚合酶, Mg2+, dNTPs和10×Buffer等,均购自TaKaRa公司，其他试剂均为分析纯；引物合成由上海生物工程有限公司完成；主要仪器有Nano Drop 2000C微量核酸蛋白测定仪、ABI Veriti 96孔多重控温梯度PCR仪、BIO-RAD水平电泳系统及Syngene G: BOX凝胶成像系统等。

1.2 方法

1.2.1 枫香树基因组DNA的提取与检测 采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)和试剂盒等方法[29-31]，并改进试剂质量浓度和处理方法，用ddH2O溶解稀释至20 ng·μL-1，25 ℃保存备用。纯化后分别用1.5%的琼脂糖凝胶电泳和微量核酸蛋白测定仪对DNA进行定性和定量检测(表1)。

表1 不同提取方法的枫香树基因组DNA纯度和含量的测定结果Table 1 Determination of purity and content of genomic DNA of Liquidambar formosana by different methods

注：A.新鲜叶片；B.硅胶干燥处理叶片。

Note: A. Fresh leaves； B. Dried leaves saved in silica.

1.2.2 SRAP-PCR 反应体系的正交试验优化与检测根据盖钧镒等[32]的方法对Taq DNA聚合酶，Mg2+浓度，dNTPs浓度，SRAP引物质量浓度，模板DNA用量等5因素在4个水平上设计L16(45) 正交试验方案(表2)。

表2 枫香树SRAP-PCR反应因素水平L16(45)正交设计Table 2 Orthogonal design for SRAP-PCR optimization on Liquidambar formosana

其中，Taq DNA聚合酶用量分别为0.5、0.7、0.9、1.1 U；dNTPs浓度分别为0.1、0.12、0.14、0.16 mmol·L-1；Mg2+浓度分别为1、1.5、2、2.5 mmol·L-1；SRAP引物浓度分别为0.3、0.4、0.5、0.6 μmol·L-1；模板DNA含量分别为40、60、80、100 ng，反应总体积为20 μL。筛选SRAP引物Me3-Em11组合进行试验验证，3次重复。SRAP-PCR扩增程序为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 sec，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，5次循环；94 ℃变性30 s，50 ℃ 变性30 s，72 ℃ 延伸1 min，30次循环；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。扩增产物于1.5%的琼脂糖凝胶(含0.05%溴化乙锭)电泳检测，凝胶成像分析结果并拍照。

1.2.3 SRAP-PCR反应体系的稳定性检测 随机选择不同居群枫香树10个单株的基因组DNA为模板，筛选SRAP引物组合(Me3-Em11, Me8-Em8)，按照上述最优SRAP-PCR反应体系扩增检测，对优化确立的枫香树SRAP-PCR反应体系的稳定性进行检验。

1.2.4 数据统计处理 采用正交直观分析法和新复极差法对所得数据进行处理分析[32, 33]。

2 结果与分析

2.1 2种方法提取枫香树基因组DNA的纯度和产率

不同提取方法、叶片发育时期和处理保存方式所提取的DNA质量和产率不同(表2)。由表2可知，对不同处理的嫩叶，试剂盒法所得DNA的OD260/OD280为2.04和2.08，改良CTAB法为1.84和1.87，2者OD260/OD230都接近于2，电泳条带明亮清晰，无明显弥散拖尾现象(图1)。

1,4,5,6：硅胶干燥处理和新鲜老叶(试剂盒法和改良CTAB法)；2,3,7,8：硅胶干燥处理和新鲜嫩叶(试剂盒法和改良CTAB法)。

1,4,5,6: Dried old leaves saved in silica and fresh old leaves (Isolation kit method and modified CTAB method); 2,3,7,8: Dried tender leaves saved in silica and fresh tender leaves (Isolation kit method and modified CTAB method).

图1 不同提取方法的枫香树基因组DNA电泳检测图
Fig.1 Electrophoresis map ofLiquidambarformosanagenomic DNA extracted by different methods

2种方法提取的枫香树嫩叶DNA在含量和纯度上相差不大，均能满足后续PCR扩增要求。而对于老叶，改良CTAB法所得DNA的OD260/OD280为1.92和1.82，试剂盒法为1.64和1.45，结合OD260/OD230值分析表明,改良CTAB法提取老叶基因组DNA的产率和纯度均较试剂盒法高。后者不仅含量较低，且含有其他杂质，DNA降解较严重，将对下游PCR反应和其他DNA分子操作产生不利影响。

2.2 SRAP-PCR扩增体系的确立

2.2.1 正交试验结果分析 参照刘萌芽等[33]的方法，对枫香树基因组DNA的SRAP-PCR反应体系中Mg2+浓度, dNTPs浓度,引物浓度,Taq DNA聚合酶和模板DNA用量等设计5个因素4个水平组合的正交试验结果进行统计分析(表2)。R值结果表明，对枫香树基因组DNA的SRAP-PCR反应体系影响程度由大到小依次为：Taq DNA聚合酶，dNTPs浓度，Mg2+浓度，模板DNA用量和引物浓度；从K值来看，Taq DNA聚合酶用量为0.9 U，Mg2+浓度为1.5 mmol·L-1，dNTPs浓度为0.16 mmol·L-1，引物浓度在0.4～0.5 μmol·L-1范围都较好，模板DNA用量在80 ng最好。根据3次正交试验重复结果，初步确立枫香树基因组DNA的SRAP-PCR扩增的适宜反应体系应为：0.9 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol·L-1Mg2+、0.14 mmol·L-1dNTPs、80 ng模板DNA及0.4～0.5 μmol·L-1引物浓度。

按照表2正交试验设计的16个反应体系，随机选用Me3-Em11引物进行SRAP-PCR反应(图2)，结果表明，采用不同浓度的Mg2+,dNTPs,引物及不同用量的Taq DNA聚合酶和模板DNA的16个反应体系，其扩增结果存在明显差异。第1、14、15和16号反应体系的扩增效果较差，条带弱且多态性也较低；第2、3、4、6、7、8、9、13号反应体系多态性好，但条带均较弱；第5、10、11、12号4个反应体系的扩增结果不仅条带清晰且多态性丰富。根据遗传多样性分析要求初步选定10号反应体系：0.9 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol·L-1Mg2+、0.16 mmol·L-1dNTPs、 0.5 μmol·L-1引物及40 ng模板DNA。

1-16：不同的SRAP-PCR反应体系; M：DL2000 DNA marker.下同。

1-16：SRAP-PCR amplification patterns in different reaction systems);

M：DL2000 DNA marker. The same as below.

图2 不同反应体系中枫香树SRAP-PCR扩增图谱(引物组合Me3-Em11)
Fig.2 SRAP-PCR amplification patterns in different reaction systems (primer combination Me3-Em11)

2.2.2 SRAP-PCR 扩增体系的确立及引物筛选

由表2，图2知，考虑扩增效果及试验成本，将正交试验的模板用量由80 ng调为40 ng，而将10号反应体系的引物浓度由0.5 μmol·L-1调为0.4 μmol·L-1。最终确定枫香树基因组DNA的SRAP-PCR最优反应体系为总体积20 μL中含有1×PCR Buffer, 1.5 mmol·L-1Mg2+, 0.16 mmol·L-1dNTP, 0.5 μmol·L-1引物, 0.9 UTaq DNA聚合酶和40 ng模板DNA。在该体系下随机选用枫香树单株基因组DNA进行SRAP引物筛选，按照多态性丰富、条带清晰和重复性好的原则，在96对SRAP引物组合中筛选出18对条带清晰、稳定且多态性丰富的引物，作为枫香树基因组的扩增引物组合(图3，表3)。

图3 筛选出的18对SRAP引物Fig.3 18 pairs of screened SRAP primers

表3 SRAP引物及序列Table 3 Primer sequence(5′-3′)applied for SRAP-PCR

2.3 SRAP-PCR反应体系稳定性分析

运用上述最优反应体系，随机选择SRAP引物组合Me3-Em11和Me8-Em8，在不同居群枫香树随机选择10个单株基因组DNA进行SRAP-PCR扩增(图4)。结果显示,随机选择的引物对随机选择的基因组DNA均可扩增出多态性丰富且条带清晰的DNA片段。说明该SRAP-PCR反应体系稳定可靠，适用于枫香树基因组DNA的SRAP-PCR扩增反应。

图4 枫香树基因组DNA 的SRAP-PCR扩增图谱Fig.4 SRAP-PCR amplificaion pattern of genomic DNA from L. formosana

3 结论和讨论

改良的CTAB法可获得含量、纯度和完整性较高的枫香树基因组DNA，且实用性和性价比较高。枫香树叶片中含有大量的萜类、黄酮类、苯丙素类、多糖类、酚酸类化合物及其苷类等次生代谢产物，并且这些物质的含量随叶片成熟逐渐增多[7, 34-37]。而这些物质易与DNA结合形成极难溶解的黏稠状物质，并抑制PCR反应过程中Taq DNA酶的活性，使扩增条带模糊甚至消失，严重影响PCR的反应效果。KIM等[38]研究表明,使用抗氧化剂PVP可以提高DNA的提取产率，陈大明等[30]利用细胞区室化多酚类物质来排除干扰也获得了较好的基因组DNA。改良CTAB法可以采用针对性的手段和步骤去除枫香树基因组DNA杂质，更适合枫香树叶片基因组DNA的提取，尤其是对于硅胶快速干燥处理的枫香树老叶来说，无论DNA的产率还是电泳结果都明显优于试剂盒法，这对于特定时间内大规模调查和采样来研究DNA分子水平上的枫香树群体遗传多样性来说，具有节省时间和经费的优势。枫香树基因组DNA的SRAP-PCR最优反应体系扩增结果显示其具有多态性丰富、条带清晰、重复性和稳定性好等特点。该标记克服了RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 重复性差、SSR (Simple Sequence Repeat) 位点较少和AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 成本高等缺点。SRAP-PCR反应体系易受反应条件和扩增程序变化及物种的影响。对影响枫香树SRAP-PCR反应的5因素4水平的正交试验结果表明，Taq DNA聚合酶的用量直接影响SRAP-PCR扩增结果的重复性和稳定性：用量过低将降低反应的灵敏度，减少扩增量；用量过多则会降低反应的特异性，易出现非特异性扩增，且试验成本增高。dNTPs质量浓度是影响PCR反应的另一关键因素，该结果与樊洪泓等[39]对石斛属SRAP-PCR扩增体系的影响因素实验结果相一致，但与楚爱香[40]和任绪瑞等[41]研究结果不同，这可能是不同物种对SRAP-PCR反应体系中的影响因素敏感性差异所致。此外，多数研究结果表明引物浓度对扩增结果的影响很小[42]，也与本研究结果一致。由此可知，不同物种的基因组结构和组成有其自身的特点，从而对PCR扩增体系的敏感性有所差异，既有相似的影响因素，也有各自特殊的反应条件。因此，应对不同的物种设计不同的PCR反应条件。

以不同居群枫香树的10个随机选择个体基因组DNA为材料，采用正交试验设计建立适宜于枫香树SRAP-PCR扩增的最优反应体系，并分别利用2对SRAP引物组合进行稳定性检测。结果表明，本试验建立的枫香树SRAP-PCR反应体系稳定，可靠，可进一步应用于枫香树群体遗传多样性分析、种质鉴定、遗传连锁图谱构建和分子育种等方面研究。

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(责任编辑：梁保松)

Genomic DNA extraction and establishment of the optimal SRAP-PCR reaction system forLiquidambarformosanaHance.

LI Fangfang1,2, YANG Shaozong2, LIU Xinhong2, LI haibo2, WANG liling2, LI Yonghua1

(1.Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2.Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China)

In order to investigate theL.formosanagenomic DNA extraction methods and the optimal SRAP-PCR reaction system, two kinds of genomic DNA extraction methods for different materials were contrasted. By the orthogonal experiment design Ll6(45), five factors including Mg2+concentration, dNTPs concentration, primer concentration, Taq DNA polymerase and template DNA amount in SRAP-PCR reaction system were optimized, and the optimal SRAP-PCR reaction system suitable for genomic DNA extracted fromL.formosanawas also established. The results showed that the modified CTAB method was better than the isolation kit one, and the optimized SRAP-PCR reaction system was as follows: total volume 20 μL, containing 1×PCR Buffer, 1.5 mmol·L-1Mg2+, 0.16 mmol·L-1dNTPs, 0.9 U Taq DNA polymerase, 0.5 μmol·L-1primer, 40 ng template DNA. The effects of the five factors on SRAP-PCR amplification are different, in which, Taq DNA polymerase was the greatest， but that of template DNA amount was the least． The optimal SRAP-PCR reaction system is tested by means of ten random selected genomic DNA ofL.formosana., and the amplification pattern with rich polymorphism and clear band was obtained.

LiquidambarformosanaHance; genomic DNA extraction; SRAP-PCR; orthogonal experiment design; optimization and test of reaction system

1000-2340(2015)01-0046-06

2014-06-10

林业公益性行业科研项目(201404312)；浙江省重大科技项目(2012C12908-14)；浙江省重大科技项目(2012C12909-21)

李芳芳(1987-)，女，河南尉氏县人，硕士研究生，从事观赏园艺植物研究。

李永华(1976-)，男，河南周口人，副教授，博士。

S 722.3

A