刘达综，高慧珊，刘 娜，何洁明，徐树兰，郑常格，吕思行

(广州市生物防治站 广东广州510460)

基础研究

一株球孢白僵菌的形态及分子生物学鉴定

刘达综，高慧珊，刘 娜，何洁明，徐树兰，郑常格，吕思行*

(广州市生物防治站 广东广州510460)

利用PDA培养基，对收集自广东茂名的玉米螟(Pyrausta nubilalis)病原真菌(编号：Bba1菌株)进行分离培养。对Bba1菌株的菌落形态、产孢结构和分生孢子形态、大小进行观察和测量，从形态学初步鉴定该菌株为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)；同时对Bba1菌株的26s rDNA和rDNA ITS区域进行序列分析，与NCBI数据库中球孢白僵菌的同源性达到99%以上。最终判定来自玉米螟的病原真菌Bba1菌株为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。

白僵菌 分离 鉴定

球孢白僵菌是国内外广泛用于害虫生物防治的杀虫真菌之一，被认为是最具开发潜力的一种昆虫病原真菌，能侵染15个目149个科的700多种昆虫和10多种蝉螨。[1]球孢白僵菌(Beauveria bassiana)在分类上属于半知菌亚门(Deuteromycotina)，丝孢纲(Hyphomycetes)，丛梗孢目(Moniliales)，丛梗孢科(Moniliaceae)，白僵菌属(Beauveria)。白僵菌属的典型特征为产孢细胞(瓶梗状)常浓密簇生，有时轮生或单生，或直接生在气生菌丝、稍有分化的分生孢子梗或膨大的泡囊上，球形或瓶状，下部膨大，反复向顶部轴式产孢，形成膝状弯曲且具有小齿突的产孢轴。产孢细胞和泡囊常增生，在分生孢子梗及菌丝上聚集成卵状或球状的孢子头。分生孢子透明，壁薄。[2]传统分类学主要是根据菌株分生孢子和产孢结构判断菌种，往往受到主观作用的影响。真菌rDNA具有保守区域，在菌种分类上具有重要意义。利用rDNA的特性进行分子生物学研究，为菌株种属判定提供更为客观的依据。

本研究在Bba1菌株形态学鉴定基础上，对菌株26s rDNA和rDNA ITS区域进行PCR扩增和序列分析，以期使菌种鉴定结果更为准确、科学。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

Bba1为广州市生物防治站采自广东茂名的玉米螟病原真菌。

1.2 供试培养基

马铃薯葡萄糖培养基(Potato Dextrose Agar，PDA)参照文献[3-4]的方法配制。

1.3 方法

1.3.1 Bba1菌株在PDA培养基上菌落形态及生长情况的观察

按照文献[5]报道的方法观察记录菌落形态特征。每天定时用游标卡尺量出菌落长宽并记录，分析菌株生长情况，记录7d。定期在光学显微镜下观察菌株形态。

1.3.2 Bba1菌株分生孢子的形态大小测定

Bba1菌株在PDA培养基上培养至15d时，在无菌条件下，刮取平板上生长的白僵菌菌落，转移到三角烧瓶中，加入一定量的0.5%吐温-80无菌水和灭菌玻璃珠，在漩涡振荡器上充分振荡使孢子均匀分散，制备成孢子悬浮液。并在显微镜下用软件测定分生孢子的直径。

1.3.3 Bba1菌株的分子生物学鉴定

在无菌条件下，分别把菌株用接种针接种于液体培养基中，放于恒温振荡培养箱中培养3～7d(培养温度为26℃，湿度为95%)。将液体培养好的菌丝体经滤纸过滤，自然晾干。用材料盒收集置于4℃冰箱保存备用。方法参考文献[6]进行菌株总DNA的抽提。根据真菌26s rDNA和 rDNA的ITS区设计出特异性引物(见表1)对菌株进行检测。PCR反应体系30µL：ddH2O为12µL；2XMaster Mix为15µL；Primer 1(10µM)为1µL；Primer 2(10µM)为1µL；Template为1µL。引物ITS5/ITS4的反应条件为：96℃预变性5min；接着35个循环：94℃变性45s，56℃退火温度40s，72℃延伸40s；72℃后延伸5min，4℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 本研究所用的引物Tab.1 Primers used in the study

对Bba1菌株26s rDNA和 rDNA的ITS序列进行克隆、测序，测序结果进行Blast比对分析，利用Clustsl X和MEGA 5软件建立系统发育树。

2 结果与分析

2.1 Bba1菌株菌落形态特征

Bba1菌株在PDA培养基上的形态情况如图1所示，菌落色泽为乳白色。菌落质地为粉状，菌落薄、中间褶皱、呈放射状生长。菌落底部无色或淡黄色。在光学显微镜下Bba1菌株产孢细胞轮生或单生，分生孢子梗反复向顶部轴式产孢，结果形成膝状弯曲的具有小齿突的产孢轴。分生孢子梗光滑呈穗状，分生孢子透明，壁薄且为球形，大小为2.1μm×2.7μm，表面光滑，与球孢白僵菌特点相似。

图1 Bba1菌株在PDA培养基上的菌落形态特征Fig.1 Morphological characteristics of Bba1 strain on PDA culture medium

Bba1菌株在PDA培养基平板上的生长量如表2所示。Bba1菌株菌落生长特点是从第2d到第4d出现一个高峰，从第5d开始放慢了生长速度，到第7d菌落未覆盖满培养基。

表2 Bba1菌株菌落生长量Tab.2 Comparison of colony growth of the Bba1 strain

2.2 Bba1菌株的分子生物学鉴定

提取Bba1菌株基因组DNA为模板，利用引物SF-1/SF-4和ITSs1/ITSs4对26s rDNA和rDNA ITS区进行PCR扩增，分别得到 630bp和247bp片段。对Bba1菌株DNA模板的PCR检测结果如图2所示。

测序结果分析显示Bba1菌株26s rDNA扩增长度为558bp(GenBank基因登录号为FJ755242.1)，Bba1 菌株rDNA ITS区序列扩增长度为247bp(GenBank基因登录号为HQ722920.1)。将测序得到的两条序列片段提交到GenBank中分别与已知序列进行对比，用Clustsl X和MEGA 5软件进行分析，构建系统发育树。从图3、4看出，该菌株都与球孢白僵菌(Beauveria bassiana)在一个分支上，其同源性均为99%。通过序列分析，最终确定该菌株为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。

图2两组引物对Bba1菌株DNA模板的PCR扩增结果Fig.2Bba1 strain PCR amplification results influnced by two sets of primers

图3 Bba1菌株26s rDNA序列的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of Bba1 strain based on 26s rDNA sequences

图4 Bba1菌株rDNA ITS区域序列的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of Bba1 strain based on rDNA ITS sequences

3 讨 论

球孢白僵菌是一种重要的昆虫病原真菌，也是一类重要的环保型生物防治菌。关于球孢白僵菌的分类一直是众多学者研究的热点，单纯依靠形态特征对球孢白僵菌进行分类，很难将与其相近的菌株区分开。因此在传统形态学鉴定的基础上，利用分子生物学技术可以客观准确地判定菌株种属。本研究利用传统形态学对Bba1菌株菌落形态、分生孢子梗及分生孢子形态、大小进行测定，同时结合分子生物学方法，分别对rDNA保守区域 26s rDNA和 rDNA ITS区域进行扩增，通过测序分析，建立起系统进化树，进一步证明传统形态学鉴定结果Bba1菌株为球孢白僵菌。Bba1菌株的鉴定为下一步开展球孢白僵菌防治玉米螟制剂的研究及生产应用奠定了基础。

［1］ 李正跃，张文青. 球孢白僵菌对马铃薯块茎蛾的毒力及其与常用农药的生物相容性测定[J]. 植物保护，2005，3(31)：57-61.

［2］ 李增智. 白僵菌的分类和鉴定[J]. 中国虫生真菌研究与应用，1990(2)：89-95.

［3］ 王更生. 中药材白僵蚕主要生产条件的优化及其指纹图谱的研究[D]. 泰安：山东农业大学，2006.

［4］ 刘丹，吴淑贤，韩福生，等. 白僵菌对沙棘木蠹蛾幼虫的致病力及其生物学特性研究[J]. 河北农业大学学报，2009，2(23)：93-96.

［5］ 刘吉平，吕思行，米红霞. 生物防治白僵菌与家蚕病原白僵菌的生物学特性初步比较[J]. 蚕业科学，2011，37(3)：442-448.

［6］ 吕思行，刘吉平，汤历，等. 两广地区家蚕白僵菌的SSRs遗传多样性[J]. 昆虫学报，2012，55(10)：1142-1148.

Morphological and Molecular Identification of a Beauveria bassiana Strain

LIU Dazong，GAO Huishan，LIU Na，HE Jieming，XU Shulan，ZHENG Changge，LV Sixing*
(Guangzhou Biological Control Station，Guangzhou 510460，Guangdong Province，China)

A strain(No．Bba1)was isolated using PDA culture medium from the muscardine cadaver of Pyrausta nubilalis collected from Maoming in Guangdong Province．In this study，the colony morphology，spore structure，spore shape and size of Bba1 strain were observed and measured，and it was initially identified as Beauveria bassiana．At the same time，its 26s rDNA and rDNA ITS were sequenced and then compared with those of Beauveria bassiana in NCBI database．The results showed the homology was above 99%．Eventually，Bba1 strain was identified as Beauveria bassiana.

Beauveria bassiana；isolation；identification

S884.3

：A

：1006-8945(2015)08-0019-03

*

广东省重点科研基地建设项目(2012A061300001)；广东省科技基础条件建设项目(2013B060500004)；广州市科技基础条件平台建设项目(201509020002)。

2015-07-10