李新圃，李宏胜，罗金印，杨 峰，王旭荣

（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 农业部兽用药物创制重点实验室 甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃兰州730050）

乳房炎是奶牛的常见病和多发病，由于防治难，治疗花费大，给奶牛业带来了巨大的经济损失［1-2］。奶牛乳房炎病因十分复杂，但主要是病原微生物通过受损乳头和乳导管入侵乳腺组织引发感染。调查研究及生化鉴定试验显示，大约85%左右的临床型乳房炎乳汁中能够检出细菌，细菌种类多达20余种，其中80%以上的病原菌为无乳链球菌、停乳链球菌、金色葡萄球菌、大肠埃希菌和乳房链球菌［3-4］。目前国内外有关奶牛乳房炎病原菌的研究多集中在上述主要致病菌［5-6］，对其他细菌的研究较少。而传统的生化鉴定试验特异性低，对大部分乳汁细菌无法确定其菌种，很难满足当前乳汁细菌的鉴定要求。近年来，随着PCR技术的发展和应用，细菌有了更加方便、准确的分子生物学鉴定方法，但由于使用成本较高、并需要一定的操作技术，尚未能在国内普及使用［7-8］。本研究主要采用较为成熟的16SrDNA PCR鉴定技术，对采集的数百份临床型乳房炎乳样，进行致病菌的分离鉴定，并对其中检出率较高的条件性致病菌进行毒性研究，目的是为了进一步了解乳汁细菌的菌群分布，以及条件性致病菌的致病性和耐药性，为奶牛乳房炎的防控提供更全面的研究数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器设备和试剂 PCR扩增仪，凝胶成像仪，显微镜，电泳仪，培养箱，16SrDNA PCR试剂盒，细菌DNA提取试剂盒，药敏纸片青霉素10U、氨苄西林10μg、氯霉素30μg、红霉素15μg、卡那霉素30μg、氧氟沙星5μg、链霉素10μg、四环素30μg、万古霉素30μg，质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923、肺炎链球菌ATCC49619，MHA培养基，增菌肉汤，琼脂血平面，营养肉汤等。

1.1.2 实验动物 清洁级昆明小鼠，雌雄各半，6周～8周，16g～20g，由兰州大学GLP实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 乳样采集 302份奶牛临床型乳房炎乳样，采自甘肃、陕西、山西、宁夏等地奶牛场。用温水清洗患病乳区，酒精棉消毒乳头，弃去头2把乳，挤取适量乳汁在灭菌试管中，远途乳样挤在琼脂斜面上。采集乳样需冷藏保存，并尽快进行细菌分离。

1.2.2 细菌分离 挑取均匀乳样（或琼脂斜面上的菌落）划分在血平面上，同时接种增菌肉汤一管，37℃孵育16h～48h。从血平面上挑选单个菌落，接种到增菌肉汤中，37℃温孵育16h～48h。进行载玻片涂片、革兰染色、显微镜观察，已分离纯化的细菌可进入细菌鉴定程序，未分离纯化的细菌需重新进行血平面划分，直至细菌分离纯化方可进入细菌鉴定程序。若血平面上未长菌，而相应的增菌肉汤管长菌，则挑取肉汤管中的细菌培养物进行血平面划分、纯化。分离纯化菌株可以加入到脱脂乳中冷冻保存。

1.2.3 细菌鉴定 使用OMEGA试剂盒提取细菌DNA，并以此作为DNA模板，使用16SrDNA PCR试剂盒进行前500bp的DNA反应（必要时进行全序列DNA反应），以及PCR扩增、10g／L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像。对符合测序标准的目的片段，送北京六合华大基因科技股份有限公司进行基因测序。使用PubMed数据库的在线Blast，对所得序列片段进行搜索比对，确定细菌种属。

1.2.4 试验菌悬液 取试验菌的分离纯化株，接种到增菌肉汤中，在37℃温箱中培养16h～48h，使细菌浓度达到5麦氏浊度，采用平板菌落计数法测定试验菌浊度，计算每毫升菌悬液中菌落形成单位（CFU／mL）。必要时用增菌肉汤稀释细菌到试验浊度。

1.2.5 小鼠致病性研究 选择检出率较高的16株粪肠球菌、18株屎肠球菌和15株化脓隐秘杆菌等条件性致病菌进行小鼠致病性试验。每种菌作为一个试验组，设立对照组，每株菌使用5只小鼠，按0.5mL的注射量，小鼠腹腔注射试验菌悬液，对照组小鼠注射增菌肉汤。连续观察15d，每天记录小鼠的病理变化及死亡情况，对发病死亡小鼠进行剖解，观察内脏器官的病理变化，并通过培养肝、脾组织进行病原重分离。挑取少许肝、脾组织划分在血平面上，37℃孵育16h～48h，挑取单个菌落进行涂片、染色和镜检，如果细菌形态特征符合试验菌，说明试验菌具有致病性。根据试验组小鼠的死亡情况，在0.2mL～0.8mL之间增减试验菌注射量，同时设立相应的增菌肉汤对照组，测定小鼠半数致死量。

1.2.6 耐药性研究 对以上的条件性致病菌，参照CLSL2013和卫生行业标准 WS／T-125-1999，进行耐药性试验。粪肠球菌和屎肠球菌使用MHA培养基，化脓隐秘杆菌使用含50mL／L羊血的MHA培养基。制备0.5麦氏浊度的试验菌悬液，吸取200μL均匀点种在直径90mm的MHA培养基上，涂布均匀，放置5片抗菌素药敏纸片，倒置在培养箱中，37℃孵育16h～48h，测定抑菌圈直径，判断耐药（R）、高敏（S）和中敏（I）。同一菌株进行3次平行试验，结果取其平均值，使用ATCC质控菌株确保试验准确性。

2 结果

2.1 乳汁细菌的分离鉴定

共采集302份临床型乳房炎乳样，246份检出细菌，其中11份同时检出两种细，细菌检出率为81.5%。本次试验共检出257株细菌，总共包括27个种属。常见的主要致病菌中无乳链球菌检出率最高，为27.6%，其次是金色葡萄球菌检出率7.0%，大肠埃希菌检出率4.7%。条件性致病菌中检出率较高的是屎肠球菌、粪肠球菌和化脓隐秘杆菌，它们的检出率分别为7.0%、6.2%和5.8%。检出菌中还包括益生菌乳酸乳球菌、棉籽糖乳球菌、蒙氏肠球菌和海氏肠球菌等，它们的总检出率为10.1%。其他菌肉毒梭菌检出率较高，为8.9%（表1）。

2.2 条件致病菌的致病性

腹腔注射7.5×108CFU～1.0×109CFU的粪肠球菌和屎肠球菌，小鼠未出现明显的病理症状和死亡情况；腹腔注射2.4×108CFU～1.4×109CFU化脓隐秘杆菌，小鼠出现不同程度的精神萎靡、被毛粗乱、皮肤发暗，并在感染后1d～7d内出现死亡。剖解死亡小鼠，发现肝脏明显肿大，发黑、质脆，肺脏严重充血。接种死亡小鼠的肝、脾组织到血平面上，长出单一细菌，形态特征符合化脓隐秘杆菌。化脓隐秘杆菌对小鼠的半数致死量为4.0×107CFU～2.4×108CFU。

2.3 条件致病菌的耐药性

粪肠球菌对氨苄西林和万古霉素高度敏感，对青霉素和链霉素耐药。屎肠球菌对氨苄西林、氯霉素和万古霉素高度敏感，对青霉素、卡那霉素和链霉素耐药。化脓隐秘杆菌对卡那霉素、四环素、红霉素和链霉素既有高敏株，也有耐药株，对其他抗生素则呈高度敏感（表2）。

3 讨论

本试验从302份乳样中共检出257株细菌，主要致病菌无乳链球菌、金色葡萄球菌、大肠埃希菌、停乳链球菌和乳房链球菌的总检出率为42.4%。无乳链球菌的单一检出率就是27.6%，其中90.8%的菌株来自甘肃奶牛场的乳样。由于无乳链球菌属于接触性感染菌，主要通过挤奶员和挤奶设备传播扩散，因此本次试验涉及的甘肃奶牛场，在挤奶方式和挤奶设施方面可能存在较大的卫生隐患。山西奶牛场乳样中的检出菌比较特别，有肉毒梭菌、柠檬酸杆菌、粪产碱杆菌、水拉恩菌和普罗维登斯菌等，原因尚不清楚，有待进一步调查研究。

宁夏地区奶牛场的乳样，检出菌多为乳酸菌。乳酸菌是一类能发酵葡萄糖（或可利用的碳水化合物）产生大量乳酸的细菌，由于能够分泌过氧化氢和细菌素，具有抑制病原菌生长的作用，常作为益生菌被研究应用［9］，并且已被用于奶牛乳房炎的防治研究［10-12］。尽管益生菌可以抑制一些病原菌的生长，起到防病治病的目的，但是能从临床型乳房炎乳汁中检出，并且具有一定的检出率，说明益生菌进入乳腺组织，也能引发乳

房炎。因此，一般健康乳汁中能够检出细菌［13］，并不代表健康乳腺中原本存在细菌［14］，而是可能外界细菌入侵乳室的结果。简单将益生菌注入乳室内防治奶牛乳房炎的方法［15］是否可行，还需要进一步探讨。

表1 奶牛乳房炎致病菌的菌群分布Table 1 Microflora distribution for pathogenic bacteria of dairy cow mastitis

表2 条件致病菌的耐药性Table 2 Drug resistance of opportunistic pathogens

屎肠球菌和粪肠球菌属于乳酸菌，在2008年1126号公告中作为益生菌被规定为饲料微生物添加剂，并被研究应用至今。但研究显示，这两种肠球菌均能引起人类疾病，因此也被作为条件性致病菌进行研究报道［16］。本试验将这两种肠球菌作为条件性致病菌，进行小鼠致病性研究，发现对小鼠没有明显的致病性，但对试验抗生素表现出一定的耐药性。说明奶牛乳房炎致病菌的分布具有多样性和复杂性，可以分为主要致病菌、条件致病菌、乳酸菌和其他细菌。除主要致病菌外，条件性致病菌对小鼠也有明显的致病性，乳酸菌一般作为益生菌使用，对小鼠没有明显的致病性，但是进入到乳腺组织中，就会成为条件性致病菌引发奶牛乳房炎。

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