羊耳菊总黄酮的大孔树脂纯化工艺优化

2015-06-15陈保红刘轶华

医药导报 2015年2期

关键词：大孔黄酮流速

陈保红，刘轶华

(漯河医学高等专科学校第二附属医院药剂科，漯河 462300)

羊耳菊总黄酮的大孔树脂纯化工艺优化

陈保红，刘轶华

(漯河医学高等专科学校第二附属医院药剂科，漯河 462300)

目的探讨羊耳菊总黄酮的大孔树脂纯化工艺条件。方法以静态吸附量和解吸率为考察指标,确定最佳型号大孔树脂, 并对其进行羊耳菊总黄酮的的动态吸附-解吸实验研究，对上样浓度、上样速度、上样pH、上样量、洗脱浓度、洗脱流速、洗脱体积进行优化选择。结果最佳工艺为采用AB-8大孔树脂；最佳动态吸附条件为：上柱液浓度1.04 mg·mL-1，上柱流速为2 BV·h-1，pH为5.06。最佳洗脱条件为4倍体积的70%乙醇洗脱，洗脱流速控制在2 BV·h-1。结论 AB-8大孔树脂对羊耳菊总黄酮具有良好的吸附和解吸效果。

羊耳菊；黄酮；大孔树脂；吸附；解吸

菊科植物羊耳菊(InulacappaDC.)分布我国南方各省区，地上部分和根入药，味辛，性平，具有祛风痰、散热毒作用，用于治疗哮喘等[1]。主要含有黄酮类、三萜类、甾体类、糖类等成分[2]。有关羊耳菊总黄酮的提取工艺等方面报道近年来较多[3]，但对总黄酮的富集纯化方面报道较少。笔者在本实验中主要探讨大孔树脂对羊耳菊总黄酮纯化工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器 RE52CS-1旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，TU-1901紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，AE240型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，FD-1C-50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)。

1.2 试剂与药物羊耳菊为菊科植物羊耳菊(InulacappaDC.)干燥全草，产自贵州六盘水，经漯河医学高等专科学校药学系赵喜兰副教授鉴定为菊科植物羊耳菊的干燥全草，粉碎过60目筛(筛孔内径0.250 mm)，备用。芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，纯度>98%，批号：110752-201012)，D101、DM130、HPD300、 HPD826型大孔树脂(沧州宝恩化工有限公司，批号：110323，100821，110112，100123)，D4020型大孔树脂(上海试剂一厂，批号：120919)；AB-8、NKA-9型大孔树脂(南开大学化工厂，批号：100911，110818)。其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 标准曲线的绘制用60%乙醇溶液配制0.24 mg·mL-1芦丁对照品溶液。准确吸取对照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL于10 mL量瓶，60%乙醇溶液补至5 mL，加5%亚硝酸钠(NaNO2)溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min后加入10%硝酸铝[Al (NO3)3]溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min后加入4%氢氧化钠(NaOH)溶液4 mL，60%乙醇溶液定容，摇匀，静置20 min后，在510 nm波长处测定吸光度，芦丁质量浓度(C)为纵坐标，吸光度(A)为横坐标绘制标准曲线，计算得回归方程为Y=1.107X-0.131，r=0.999 7。结果表明芦丁浓度在0.012～0.096 g·L-1范围内呈现良好线性关系。

2.2 黄酮粗提物的制备取药材100 g，以料液比1：10加入75%乙醇1 L，超声波功率为600 W下萃取3次，每次3 h，滤过，合并，浓缩至0.5 g·mL-1原生药，备用。

2.3 大孔树脂的预处理树脂适量，95%乙醇浸泡24 h，去除杂物，湿法上柱，95%乙醇洗涤至没有白色浑浊为止，然后纯化水洗至无乙醇味为止。分别采用 5% HCl和2% NaOH 溶液以2倍树脂床体积(The resin bed volume，BV)·h-1洗脱，共洗脱2 BV，纯化水洗至中性，备用。

2.4 树脂的筛选

2.4.1 吸附量和解析率的测定称取预处理的树脂各3.0 g于100 mL锥形瓶中，精密移取黄酮粗提物20 mL(浓度1.56 mg·mL-1)，110 r·min-1震荡24 h，吸附，过滤，测定滤液中总黄酮含量，计算各种树脂的静态吸附量。取吸附饱和后的树脂置于100 mL锥形瓶，分别精密加入75%乙醇20 mL，110 r·min-1震荡24 h，过滤，测定平衡液中总黄酮含量，计算静态解吸率。[吸附量(mg·g-1) =(原液总黄酮含量×原液体积-吸附液总黄酮含量×吸附液体积)/树脂质量；解吸附量 (mg·g-1)=解析液总黄酮含量×解析液体积)/树脂质量；解析率(%)=解吸附量/吸附量][4]。

2.4.2 大孔吸附树脂的静态吸附动力学特性测定精密称取预处理的树脂3.0 g于100 mL锥形瓶，精确加入样品溶液20 mL(浓度1.56 mg·mL-1)，110 r·min-1震荡12 h，每隔1 h吸取上清液测定总黄酮的含量，绘制静态吸附动力学曲线。

2.5 树脂动态吸附与解吸工艺参数研究将筛选出的理想树脂5 g湿法装入层析柱中(径高比1：8)，考察上柱液浓度、pH、上样流速对吸附效果的影响以及洗脱剂浓度、体积、流速对洗脱效果的影响。

2.6 大孔树脂的筛选

2.6.1 不同树脂对羊耳菊总黄酮的静态吸附和解吸实验树脂的吸附效果与树脂极性、孔径、比表面积存在一定的关系[5]。由表1可知，非极性 D101、D4020和弱极性AB-8的解吸附能力都较好，非极性HPD300、氢键HPD826吸附量较高，但是解析效率较低。因此选择D101、D4020和AB-8进行静态吸附动力学实验。

2.6.2 静态吸附动力学特性测定图1显示，树脂吸附4 h后，D101、D4020、AB-8树脂基本达到吸附平衡，属于快速平衡型，尤以AB-8树脂达到饱和的速度比其他树脂快，而且吸附量大于其他型号的树脂。

2.7 AB-8树脂动态吸附实验

2.7.1 上样液浓度的影响 AB-8树脂5 g湿法装柱，将黄酮粗提液(1.56 mg·mL-1)加纯化水稀释成1.33，1.17，1.04，0.93，0.85，0.78，0.67，0.58 mg·mL-1的样液各3 BV，以流速2 BV·h-1[BV·h-1指柱内单位时间(h)流经单位体积树脂平均液量]、pH保存不变的条件下上样，上样完毕，3 BV纯化水以2 BV·h-1流速过柱，收集流出液和洗脱液，测定黄酮含量，计算吸附量。结果见图2所示，AB-8树脂吸附量随浓度的增大而加大，但浓度达到1.04 mg·mL-1，吸附量变化幅度不大。综合考虑选择1.04 mg·mL-1样品液上样。

2.7.2 上样速率的考察将3 BV样液(1.04 mg·mL-1)分别以1，2，3，4，5 BV·h-1流速进行上样，上样完毕，3 BV纯化水以2 BV·h-1流速过柱，收集流出液和洗脱液，测定黄酮含量。图3显示，伴随流速的增加，树脂的吸附量在减少，流速过慢时，吸附量增加，但循环周期延长。因此，综合考虑工作效率和吸附效果，控制流速2 BV·h-1较理想。

2.7.3 样液的pH的确定用稀氨水和稀盐酸调节样液(1.04 mg·mL-1)pH为3.07，4.06，5.06，6.07，7.08上柱，流速2 BV·h-1，上样完毕，3 BV纯化水以2 BV·h-1流速过柱，收集流出液和洗脱液，测定黄酮含量。由图4可见，pH5.06树脂吸附量最大，这可能是由于黄酮类化合物多为多羟基酚类化合物，呈弱酸性，因此酸性条件下吸附量最好。但如果pH过低，容易形成烊盐，吸附效果变差。

2.7.4 上样液体积的考察处理好的AB-8大孔树脂5 g湿法装柱，样液(浓度为1.04 mg·mL-1)以2 BV·h-1流速上样，收集流出液，每份1 BV，检测流出液黄酮含量。由图5结果显示，上样体积<3 BV时泄漏较少，>3 BV时样液泄漏明显，体积达10 BV时，流出液的总黄酮浓度与上样液接近，此时树脂已基本吸附饱和。

2.8 动态洗脱实验

2.8.1 洗脱剂乙醇浓度的确定 AB-8大孔树脂5 g湿法装柱，取1.04 mg·mL-1样液，以流速2 BV·h-1上样，依次采用3 BV纯化水，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%乙醇梯度以2 BV·h-1流速洗脱，收集流出液，测定黄酮含量，计算解析率。图6显示，当乙醇浓度达到70%时，解析率最高，可能与黄酮极性较弱相关，与70%乙醇的极性相当。乙醇浓度过大时，杂质容易洗脱下来。

2.8.2 洗脱剂流速的确定 AB-8大孔树脂湿法装柱，取样液(浓度1.04 mg·mL-1)以流速为2 BV·h-1上样，充分吸附，2 BV去离子水冲洗，3 BV的70%乙醇以1，2，3，4，5 BV·h-1的流速洗脱，收集流出液，测定黄酮的含量。由图7可以看出，伴随流速的增加，黄酮的解析率逐步减少；若流速过慢则循环周期延长，以选择流速2 BV·h-1较理想。

表1 7种树脂静态吸附及解吸性能比较

图1 树脂静态吸附动力学曲线

图2 不同上样液浓度的吸附量的变化曲线

图3 不同流速的吸附量的变化曲线

图4 不同pH的吸附量的变化曲线

图5 不同上样体积羊耳菊总黄酮泄漏曲线

图6 不同乙醇浓度的解析率的变化曲线

图7 不同洗脱剂流速的解析率的变化曲线

2.8.3 洗脱曲线 AB-8大孔树脂湿法装柱，取样液(浓度1.04 mg·mL-1)以流速2 BV·h-1上样，充分吸附，2 BV纯化水洗脱，70%乙醇以2 BV·h-1流速洗脱，分段收集洗脱液，每段1 BV。图8显示，当洗脱量为4 BV时，树脂上的黄酮基本完全洗脱。故洗脱剂用量的确定为4 BV。