邹江冰，袁进，蒋琳兰

(广州军区广州总医院药学部，广州 510010)

紫果西番莲叶提取物抗焦虑作用及其机制*

邹江冰，袁进，蒋琳兰

(广州军区广州总医院药学部，广州 510010)

目的 探讨紫果西番莲叶提取物的抗焦虑作用及其机制。方法 60只小鼠随机分为空白对照组、阳性对照组和提取物大、中、小剂量组共5组。提取物大、中、小剂量组分别灌胃紫果西番莲提取物 800，400，200 mg·kg-1·d-1，阳性对照组给予地西泮2 mg·kg-1·d-1，空白对照组灌胃等容积1%羧甲基纤维素钠，各组连续给药7 d。以高架十字迷宫(EPM)实验为动物模型，考察紫果西番莲叶的抗焦虑活性；用聚合酶链反应(PCR)法对扩增产物进行分析。结果 紫果西番莲叶醇提物(400，800 mg·kg-1·d-1)能增加小鼠在开臂内运动时间和次数百分率，并且提高小鼠在开场中央区的次数；实时荧光定量PCR法分析表明，紫果西番莲叶醇提物(400，800 mg·kg-1·d-1)能上调EPM焦虑小鼠脑组织中GABAA受体α2亚型和α3亚型mRNA表达水平。结论 紫果西番莲叶醇提物具有明显的抗焦虑作用，其作用机制可能与调节GABAA受体α2亚型和α3亚型mRNA表达水平有关。

紫果西番莲叶；焦虑；高架十字迷宫；γ-氨基丁酸A型受体

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性昆明种小鼠60只，级别：SPF，初始体质量20～25 g，合格证号：SCXK(粤)2008-0002，购自广东省医学实验动物中心。小鼠饲养于广州军区广州总医院动物实验室SPF动物房。光照节律12L：12D(7：00～19：00)，室温(18±2) ℃，相对湿度约50%，动物可以自行摄取标准饲料和清洁饮用水。

1.2 药物与试剂 紫果西番莲叶采自广东梅州五华县，经华南植物研究所韦强老师鉴定为西番莲属西番莲科植物紫果西番莲(PassifloraedulisSims)的干燥叶；羧甲基纤维素钠(sodium carboxyl methyl cellulose，CMC)；地西泮(上海信谊医药公司，批号：10021122)；Trizol试剂(TaKaRa Code：D9108A)；焦碳酸二乙酯(DEPC，广州威佳科技有限公司)；DL2000 DNA Marker(大连宝生物有限公司)；EB溶液(上海申能博彩生物公司)；M-MLV逆转录酶(nvitrogen)；SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)；Loading Buffer(TaKaRa)。引物合成和测序由上海捷瑞生物科技公司完成。

1.3 仪器 小鼠高架十字迷宫(采用国际通用方法制作[3-4])；NANO DROP 2000；恒压电泳仪(北京六一仪器厂)；恒温水浴槽(上海精宏实验设备公司)；Gene Q基因扩增仪(杭州博日科技有限公司)；荧光定量PCR仪(Qiagen公司)；凝胶成像系统(Universal Hood)Ⅱ(Bio-Rad公司)。

1.4 溶液的制备 取紫果西番莲叶粗粉160 g，用15倍量的60%乙醇80 ℃回流提取3次，每次2 h，合并滤液，滤液经旋转蒸发减压干燥得紫果西番莲叶醇提物，临用前用1%CMC进行溶解。地西泮用1% CMC配成0.125 mg·mL-1溶液，4 ℃保存，使用前混摇均匀。

1.5 动物分组与给药方法 将小鼠随机分为空白对照组、阳性对照组和紫果西番莲提取物大、中、小剂量组共5组。其中紫果西番莲提取物大、中、小剂量组分别按 800，400，200 mg·kg-1·d-1灌胃给药[5]，阳性对照组给予地西泮2 mg·kg-1·d-1，空白对照组灌服等容积1%CMC。各组连续给药7 d，于第 7天在末次给药1 h后8 ：00～16 ：00进行行为测试。

1.6 小鼠高架十字迷宫(EMP)实验 高架十字迷宫包括两个开臂(长30 cm，宽5 cm)与两个闭臂(长30 cm，宽5 cm，高15 cm)距地面50 cm。迷宫测试前将每只小鼠放入一个45 cm× 35 cm× 20 cm塑料盒中，任其自由探究5 min后迅速置于EPM的中央平台处，使其头部正对其中1个开放臂，记录5 min内小鼠进入开臂次数(open arm entry,OE)、闭臂次数(close arm entry,CE)和迷宫中央区内的次数及在开臂与闭臂的运动时间。以进入开臂次数与总入臂次数的百分率(open enter percent,OE%)及在开臂内运动时间与入臂总时间百分率(open time percent,OT%)代表抗焦虑作用指标。整个行为过程用摄像机摄像。每测试完一只用湿布擦拭迷宫，清除粪便，用干布擦拭干净后再进行下一只小鼠的测试。

1.7 鼠脑组织中γ-氨基丁酸A型(GABAA)受体α2和α3亚型mRNA表达的检测 小鼠 EPM行为学测试结束后，立即处死，每组分别取5只小鼠的脑组织，无菌条件下分离全脑，将脑组织置于预冷的研钵中，在液氮条件下捣碎成粉末，按试剂盒说明用TRIzol试剂提取脑组织总RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳来鉴定RNA的完整性后，用半定量RT-PCR方法检测GABAA受体α2亚型和α3亚型mRNA水平的表达，以β-actin作为内参照，α2亚型上游引物5′-GCTACGCTTAC-ACAACCTC-3′，下游引物5′-TCATTGACTACACT-CTTCC-3′；α3亚型上游引物5′-CAACTACTTCACC-AAGCGG-3′，下游引物5′-CGGGAAATTTTGTCAACCT-3′ ；PCR反应条件：94 ℃ 5 min预变性，94 ℃ 30 s，53.6 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，扩增38个循环，72 ℃延伸7 min，PCR产物进行3%琼脂糖凝胶电泳。Real-time PCR分析：α2亚型上游引物5′-AATCT-GGACTCCTGATACCTTC-3′，下游引物5′-CATTCGG-CTTGGACTGTAAG-3′；α3亚型上游引物5′-AAGT-AGCACAGGATGGCTCACG-3′，下游引物5′-ACATGG-CAAGTAGGTCTGGATGAC-3′ ；Real-time PCR反应结束后，应用PCR仪软件分析反应结果，检测各样本中的Ct值，以Delta-deltaCt法分析各组GABAA受体α2亚型和α3亚型基因相对表达量。

2 结果

2.1 小鼠高架十字迷宫实验结果 结果表明，与空白对照组比较，紫果西番莲醇提物在400，800 mg·kg-1的剂量下可以明显增加OT%和OE%(P<0.01)，不增加总入臂次数(总入臂次数代表大鼠的运动活力)，说明紫果西番莲叶醇提物在此模型上有明显的抗焦虑作用。见表1。

表1 5组小鼠总入臂次数，入开放臂次数比例和开放臂停留时间比例比较

与空白对照组比较，*1P<0.01

Compared with blank control group，*1P<0.01

2.2 RNA电泳结果 总RNA经过琼脂糖凝胶电泳后，28 s和18 s两条RNA带清晰可见，28 s条带亮度约为18 s条带的2倍，表明RNA有较好的完整性，没有降解，见图1。紫外分光光度计检测RNAA260/A280比值均在1.8～2.2，表明纯度符合要求。

图1 小鼠脑组织总RNA电泳图

2.3 对小鼠脑组织中GABAA受体α2亚型和α3亚型mRNA的影响 结果见图2。从图2可以看出，与空白对照组比较，阳性对照组、紫果西番莲叶提取物大和中剂量组α2亚型和α3亚型目的片段的光亮度都有所增加，与药效实验结果一致。

2.4 Real-time PCR实验结果 见图3，4。

3 讨论

紫果西番莲在巴西民间作为治疗焦虑症的药物，文献研究表明，紫果西番莲提取物与地西泮的不同之处是在抗焦虑的同时，不阻断记忆过程[6]。

1.阳性对照组；2.提取物大剂量组；3.提取物中剂量组；4.提取物小剂量组；5.空白对照组；6.DL2000 maker ；a.α2目的条带；b.α3目的条带；c.β-actin目的条带

图2 RT-PCR检测5组小鼠脑组织中GABAA受体α2亚型和α3亚型 mRNA的影响

1. positive control group; 2. high-dose extract group; 3. medium-dose extract group; 4. low-dose extract group; 5. blank control group; 6. DL2000 maker; a. α2target band；b.α3target band；c.β-actin target band

Fig.2 mRNA expression of GABAA-α2and GABAA-α3receptor in five groups of mice brain by RT-PCR

本研究采用RT-PCR和Real-time PCR两种方法对紫果西番莲叶提取物是否通过GABAA型受体α2亚型和α3亚型来发挥抗焦虑作用进行了探讨，结果显示800及400 mg·kg-1·d-1的紫果西番莲叶提取物相对于空白对照组，α2亚型和α3亚型 mRNA的相对表达量差异有统计学意义(P<0.01)，提示紫果西番莲提取物的抗焦虑作用与GABAA型受体有关。

A.扩增曲线；B.溶解曲线；a.空白对照组；b.提取物小剂量组；c.提取物中剂量组；d.提取物大剂量组；e.阳性对照组；与空白对照组比较，*1P<0.01

图3 Real-time PCR检测5组小鼠脑组织中GABAA受体α2亚型 mRNA

A.amplification curve; B. dissociation curve; a.blank control group; b. low-dose extract group; c. medium-dose extract group;d. high-dose extract group; e. positive control group; Compared with blank control group,*1P<0.01

Fig.3 mRNA expression of GABAA-α2receptor in five groups of mice brain by real-time PCR

A.扩增曲线；B.溶解曲线；a.空白对照组；b.提取物小剂量组；c.提取物中剂量组；d.提取物大剂量组；e.阳性对照组；与空白对照组比较，*1P<0.01

图4 Real-time PCR检测5组小鼠脑组织中GABAA受体α3亚型 mRNA

A.amplification curve; B. dissociation curve; a.blank control group; b. low-dose extract group; c. medium-dose extract group;d. high-dose extract group; e. positive control group; Compared with blank control group,*1P<0.01

Fig.4 mRNA expression of GABAA-α3receptor in five groups of mice brain by real-time PCR

[1] 邹江冰，孔秋玲，陈龙浩，等.不同产地紫果西番莲叶中总黄酮的含量测定[J].医药导报，2012，31(3)：348-349.

[2] 周玉娟，谈锋，邓君.西番莲属植物的研究进展[J].中国中药杂志，2008，33(15)：1789-1793.

[3] PELLOW S ，CHOPIN P ，FILE S E ，et al .Validation of open ：closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat[J].J Neurosci Methods ，1985，14(3) ：149-167.

[4] LISTER R G.The use of a plus-maze to measure anxiety in the mice[J].Psychopharmacology(Berl) ，1987 ，92(2)：180-185.

[5] REGINATTO F H，DE-PARIS F，PETRY R D，et al.Evalua-tion of anxiolytic activity of spray dried powder of two South Brazilian Passiflora species[J].Phytother，2006，20(5)：348-351.

[6] BARBOSA P R，VALVASSORI S S，BORDIQNON C L Jr，et al.The aqueous extracts ofPassifloraalataandPassifloraedulisreduce anxiety-related behaviors without affecting memory process in rats[J].Med Food，2008，11(2)：282-288.

Anxiolytic Effects ofPassifloraedulisExtract and Its Mechanism

ZOU Jiangbing, YUAN Jin, JIANG Linlan

(DepartmentofPharmacy,GuangzhouGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand,Guangzhou510010,China)

Objective To investigate the anxiolytic effects of the ethanol extract ofPassifloraedulisand the related mechanism. Methods Sixty mice were randomly divided into five groups,including blank control group,positive control group,high-dose,medium-dose,and low-dose extract groups. Mice of high-dose,medium-dose,and low-dose extract groups were given 800，400，200 mg·kg-1·d-1of extract of Passilora edulis.Mice of positive control group were given 2 mg·kg-1·d-1of diazepam. Mice of blank control group were given equal volume of 1% sodium carboxyl methyl cellulose.Mice in all groups were treated for 7 consecutive days. Elevated plus-maze (EPM) test was used to assess antianxiety effect ofPassifloraedulisinKunmingmice.Amplified products were analyzed by PCR. Results The ethanol extract ofPassifloraedulis(400 and 800 mg·kg-1·d-1) significantly increased the percentage of the times of mouse entering the open arms and stay duration in the total period and it could increase the time of passing the box.Real-time fluorescence quantification PCR showed that the ethanol extract ofPassifloraedulis(400 and 800 mg·kg-1·d-1) increased the mRNA expression of α2and α3subunits of GABAAreceptor. Conclusion The ethanol extract ofPassifloraedulisexerts anti-anxiety effect in the elevated plus-maze test.The mechanism is related to regulation of the mRNA expression of α2and α3subunits of GABAAreceptor.

Passiloraedulis; Anxiolytic; Elevated plus-maze; GABA receptor

2014-01-26

2014-02-21

*广东省中医药局科研课题(2010253)

邹江冰(1974-)，女，湖南新化人，主管药师，硕士，研究方向：天然药物及医院制剂。电话：020-36652003，E-mail：jbz429@163.com。

蒋琳兰(1962-)，女，浙江杭州人，主任药师，硕士，研究方向：天然药物及医院制剂。电话：020-36653476，E-mail：jlinlan@163.com。

R965

A

1004-0781(2015)02-0166-04

DOI 10.3870/yydb.2015.02.006