刘欣伟，柳云恩，张玉彪，周大鹏，赵 勇，项良碧，侯明晓

1.沈阳军区总医院骨科，辽宁沈阳 110016;2沈阳军区总医院全军重症战创伤实验室，辽宁沈阳 110016

褪黑素对脊髓的保护作用逐渐被认识[1-4]，有学者通过在大鼠神经损伤后即刻施加褪黑素干预来观察其对脊髓损伤的保护作用并研究其机制。然而，在临床工作中却经常会遇到一些无法在第一时间来院进行治疗的神经损伤患者，对于这部分进行神经损伤延迟修复的患者，褪黑素的保护作用报道较少。本研究通过Masson染色及免疫组织化学方法观察褪黑素对大鼠坐骨神经损伤延迟修复后的神经保护作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康成年雄性SD大鼠48只，体重205～235 g。由沈阳化工学院新药安全评价中心动物部提供[许可证号:SYXK(辽)2006-0002]。

1.1.2 试剂及仪器 褪黑素(Melatonin，MT)，免疫组化染色试剂盒及一抗多克隆抗体(北京索来宝公司)。水合氯醛、无水乙醇及其他溶剂由沈阳军区总医院药学部提供。低温冰箱(日本三洋公司)、电子天平及干燥箱(上海民桥科学精密仪器公司)、冰冻切片机(德国莱卡公司)、光学及倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)、离心机(德国西格玛公司)、Image Pro Plus图像分析软件(美国GE公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 建模和分组 将48只SD大鼠按随机数字表法分为4组:延迟1 d修复组(n=12)、延迟1周修复组(n=12)、延迟1个月修复组(n=12)和延迟2个月修复组(n=12)。分别在坐骨神经横断性损伤后1 d、1周、1个月及2个月后进行缝合修复。每组大鼠又随机分为:实验组(n=6)和对照组(n=6)。实验组大鼠在神经修复完成后立即给予褪黑素100 mg/kg溶于无水乙醇溶剂中，行腹腔注射，而对照组大鼠不给予褪黑素。

1.2.2 手术步骤 大鼠以水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后备皮，钳夹皮肤没有明显痛觉反应后，显露任意一侧坐骨神经。在坐骨神经分叉点近端1 cm处，使用锋利刀片将坐骨神经切断。在制作神经损伤延迟修复模型中，为防止神经离断后近端神经自行长入远端，将近端神经埋入邻近肌肉中，使用10-0缝线缝合肌肉和神经。术毕，放入笼中饲养。各组大鼠分别在相应的时间点(1 d、1周、1个月、2个月)予以褪黑素药物干预，然后放入笼中继续饲养。5 d后处死大鼠，取断端、近端和远端神经，放入液氮或4%多聚甲醛中等待后续处理。

1.2.3 Masson染色 取术后5 d的神经标本制作石蜡切片。然后脱蜡至蒸馏水;Weigert铁苏木精染色5～10 min，蒸馏水稍冲洗;盐酸乙醇分化液分化，蒸馏水冲洗数分钟;稀氨水溶液返蓝15 s，蒸馏水稍洗;丽春红酸性品红液染5～10 min，蒸馏水稍冲洗;1% 冰醋酸处理1 min;95%乙醇脱水多次;无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.2.4 免疫组织化学 取术后5 d的神经标本制作石蜡切片，切面与神经走行平行。然后脱蜡至蒸馏水。3%H2O2孵育10 min。PBS洗2～3遍后进行抗原修复。普通山羊血清封闭15 min，倾干后滴加兔抗鼠转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)多抗(1：50)，4 ℃ 下孵育过夜。PBS洗3遍，滴加适量生物素标记工作液，37℃孵育30 min。PBS冲洗2～3遍后，加入辣根过氧化物酶联羊抗兔IgG二抗孵育15 min。PBS洗3遍，DAB常温下显色5 min。PBS洗10 min后，苏木精复染2 min，蒸馏水冲洗10～15 min。脱水，透明，封片，镜检。

2 结果

2.1 一般情况 给予褪黑素5 d后观察，4组大鼠无论是否给予褪黑素，都存在不同程度的足踝下垂以及行动不便。这种现象可能与恢复时间较短有关。

2.2 Masson染色 在延迟1 d修复组和延迟1周修复组中，对照组和实验组大鼠的远端坐骨神经尚未发生组织崩解，几近正常组织学形态，排列紧密，互相平行，轴突连续，轴突周围围绕着一层厚厚的淡红色髓鞘，施万细胞核深红褐色，形态正常，神经膜呈蓝色。而在延迟1个月修复组和延迟2个月修复组中，神经纤维结构不存在，严重紊乱，大量变性、脱失的髓鞘以及大量溶解或裂解的施万细胞核呈碎片状。除此之外，胶原纤维大量充斥在崩解的神经纤维组织之间，并且随着延迟修复时间的延长，胶原纤维的比例越来越多，发生华勒氏变性的神经细胞以及失神经接触的施万细胞散落在胶原纤维之间。见图1。

图1 术后5 d各组大鼠坐骨神经Masson染色

2.3 TGF-β抗体免疫组织化学染色 随着延迟修复时间的延长，无论实验组或对照组，TGF-β抗体染色阳性细胞数越来越密，提示随着延迟修复时间的延长，成纤维细胞不断浸润远端神经。该结果与Masson染色的结果一致，在神经离断后短期内，成纤维细胞浸润较少，胶原纤维的表达和合成较少。随着时间的延长，组织中的成纤维细胞越来越多，因此，神经组织中出现大量的胶原纤维。见图2。

3 讨论

以往研究发现，周围神经损伤后不仅会发生生理变化，而且往往伴随着病理和细胞代谢的改变[5-8]。神经生长速度缓慢，神经断端以远的施万细胞对再生神经的支持随着失神经支配时间的延长会越来越弱。大鼠的坐骨神经纤维需要大约1个月才能全部生长通过神经缝合处[9-10]。学者们研究了褪黑素对神经损伤的保护作用，发现褪黑素对大鼠的神经损伤有明显的保护作用，可以缩短轴突再生通过断端的时间，利于神经损伤的修复。

然而，这些实验大多是在建立神经损伤模型后立即给予褪黑素[11-12]。在临床实际工作中，会有一部分患者由于各种条件限制，无法在受伤后第一时间就诊，较早的手术治疗在伤后12 h内[13]，这对患者神经损伤治疗的预后造成了不利影响。本研究在前期实验中观察到坐骨神经损伤后延迟修复时，褪黑素促进神经再生不是持续有效的，褪黑素的有效期限为神经损伤后1个月以内。本研究中设计了神经损伤延迟修复的药物干预动物模型，以观察褪黑素在这种情况下对坐骨神经的保护作用。4组动物分别在神经损伤后1 d、1周、1个月和2个月后给予修复。实验组给予了褪黑素药物干预，术后5 d观察到所有动物术侧后肢都存在不同程度的跛行现象，分析其原因可能与恢复时间较短有关。

图2 各组大鼠坐骨神经TGF-β抗体免疫组织化学染色

Masson染色和TGF-β抗体的免疫组织化学染色结果提示，在延迟1 d和延迟1周修复组，无论是对照组还是实验组，Masson染色中胶原纤维面积比例都不超过20%，随着神经损伤后修复时间的延迟，胶原纤维面积逐渐增大。在延迟1 d修复组和延迟1周修复组中，神经纤维的结构尚存在，髓鞘饱满，而胶原纤维很少;TGF-β染色的成纤维细胞的浸润也相对较少。而从延迟1个月修复组开始，可以发现神经完全崩解，连续的神经结构被散落存在的施万细胞以及胶原纤维所代替，TGF-β染色的成纤维细胞的密度较前两组高。由于TGF-β可以调节细胞的增殖和分化，刺激多种细胞因子、炎症介质等活性物质的合成和分泌及细胞外基质的产生。因此，在组织纤维化中起重要作用，是目前已知的可以诱导多种组织纤维化的最具代表性的一种细胞因子[14-15]。在延迟1个月和延迟2个月修复组中，TGF-β免疫组织化学染色明显强于延迟1 d和延迟1周修复组，表明随着修复时间的延长，神经远端组织的纤维化程度明显加重。这个现象提示，周围神经损伤1个月后，组织退变及神经远端组织的纤维化是神经延迟修复后褪黑素不再能够促进神经再生的原因之一。

综上所述，本研究认为，褪黑素对坐骨神经损伤存在一定的保护作用，坐骨神经损伤后延迟修复的时间对于褪黑素对坐骨神经损伤的保护作用存在影响。

[1]Huang CT，Chiang RP，Chen CL，et al.Sleep deprivation aggravates median nerve injury-induced neuropathic pain and enhances microglial activation by suppressing melatonin secretion[J].Sleep，2014，37(9):1513-1523.

[2]Chang HM，Liu CH，Hsu WM，et al.Proliferative effects of melatonin on Schwann cells:implication for nerve regeneration following peripheral nerve injury[J].J Pineal Res，2014，6(3):322-332.

[3]Kaya Y，Sarikcioglu L，Yildirim FB，et al.Does circadian rhythm disruption induced by light-at-night has beneficial effect of melatonin on sciatic nerve injury?[J].J Chem Neuroanat，2013，53:18-24.

[4]Chiang RP，Huang CT，Tsai YJ.Melatonin reduces median nerve injury-induced mechanical hypersensitivity via inhibition of microglial p38 mitogen-activated protein kinase activation in rat cuneate nucleus[J].J Pineal Res，2013，54(2):232-244.

[5]Castillo-Galván ML，Martínez-Ruiz FM，de la Garza-Castro O，et al.Study of peripheral nerve injury in trauma patients[J].Gac Med Mex，2014，150(6):527-532.

[6]Zhang T，Li Z，Dong J，et al.Edaravone promotes functional recovery after mechanical peripheral nerve injury[J].Neural Regen Res，2014，9(18):1709-1715.

[7]Wang W，Gao J，Na L，et al.Craniocerebral injury promotes the repair of peripheral nerve injury[J].Neural Regen Res，2014，9(18):1703-1708.

[8]Drummond PD.Neuronal changes resulting in up-regulation of alpha-1 adrenoceptors after peripheral nerve injury[J].Neural Regen Res，2014，9(14):1337-1340.

[9]Kavlak E，Belge F，Unsal C，et al.Effects of pulsed electromagnetic field and swimming exercise on rats with experimental sciatic nerve injury[J].J Phys Ther Sci，2014，26(9):1355-1361.

[10]Xu L，Zhou S，Feng GY，et al.Neural stem cells enhance nerve regeneration after sciatic nerve injury in rats[J].Mol Neurobiol，2012，46(2):265-274.

[11]Jing Y，Wu Q，Yuan X，et al.Microvascular protective role of pericytes in melatonin-treated spinal cord injury in the C57BL/6 mice[J].Chin Med J(Engl)，2014，127(15):2808-2813.

[12]Piao MS，Lee JK，Jang JW，et al.Melatonin improves functional outcome via inhibition of matrix metalloproteinases-9 after photothrombotic spinal cord injury in rats[J].Acta Neurochir(Wien)，2014，156(11):2173-2182.

[13]Li Y，Walker CL，Zhang YP，et al.Surgical decompression in acute spinal cord injury:A review of clinical evidence，animal model studies，and potential future directions of investigation[J].Front Biol，2014，9(2):127-136.

[14]Joko M，Osuka K，Usuda N，et al.Different modifications of phosphorylated Smad3C and Smad3L through TGF-β after spinal cord injury in mice[J].Neurosci Lett，2013，549:168-172.

[15]Zhang Y，Chen J，Hu L，et al.Androgen deprivation induces bladder histological abnormalities and dysfunction via TGF-β in orchiectomized mature rats[J].Tohoku J Exp Med，2012，226(2):121-128.