司红彬，吴永继，徐素萍，黄丽云，秦 燕，姚晓韵，潘 婕，黄 凯＊，夏 娟，唐承明

（1广西大学动物科学技术学院；广西南宁530005；2广西壮族自治区兽药监察所；广西南宁530001）

白头翁为临床常用清热凉血药之一，属于毛莨科植物白头翁Pulsatilla chinensis（Bunge）Regel的干燥根，多分布于河南、山东、吉林、黑龙江等地区。味苦性寒，归胃、大肠经，具有清热解毒、凉血止痢之功效，是治痢之要药。临床用于治疗阿米巴痢疾、细菌性痢疾和抗阴道滴虫等疾病［1－3］。现代研究表明该药具有抗病毒［4］，对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、痢疾杆菌有抑制作用［5］，也有研究报道该药还具有抗炎、提高免疫力、保肝、抗肿瘤作用［6－7］，可能对日本血吸虫感染有一定的治疗和预防作用［8］。目前，细菌耐药性问题越来越严重，畜牧养殖领域也是如此，甚至连养殖领域的细菌对兽医领域严禁使用的药物都能产生耐药性，如磷霉素。磷霉素为兽医领域临床严禁使用的药物，目前分离到含该耐药基因的文献报道还不多［9］，理论上不应该在兽医领域分离到耐磷霉素基因（fosfomycin resistance gene，fosA3）的细菌。但2013年文献报道中国从食品源动物分离到10株产fosA3耐药基因的大肠埃希菌［10］。本次试验分离到同时含有质粒介导的超广谱β－内酰胺酶（extended spectrum betalactamases，ESBLs）和fosA3基因的大肠埃希菌，并通过白头翁水提取物联合抗菌药对临床分离同时含fosA3型和ESBLs型耐药基因的大肠埃希菌体外抑菌效果进行研究，为该类耐药性细菌感染疾病的防治提供治疗方法。

1 材料与方法

1.1 材料

白头翁购自广西万丰药业有限公司，肠杆菌科细菌生化鉴定管、MH 肉汤、SS琼脂、麦康凯琼脂均为杭州天河微生物试剂有限公司；抗菌药：头孢曲松钠（ceftriaxone sodium）、阿莫西林（amoxicillin）、诺氟沙星（norfloxacin）、加替沙星（gatifloxacin）、盐酸环丙沙星（ciprofloxacin）、左旋氧氟沙星（levofloxacin）、黏杆菌素（coly－mycin）、痢菌净（mequindox）、磺胺间甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine）、阿米卡星（amikacin）、头 孢 他 啶（ceftazidime）、头 孢 噻 呋 钠（ceftiofur sodium）、氟苯尼考（florfenicol）、磷霉素（fosfomycin）均在有效期范围内。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离鉴定 从病鸡的典型病变组织肝脏中无菌钓取部分病料，于麦康凯琼脂平板和SS平板上划线，37 ℃培养18h，挑取单个菌落接种于MH 肉汤，进行培养和再纯化，然后按照生化鉴定管方法对菌落进行鉴定。

1.2.2 白头翁水提取物制备 称取白头翁100g，用蒸馏水清洗并浸泡4h，然后分别加入中药体积的10、8、6倍体积的水进行煎煮，煎煮时每次煮沸后改为文火继续煎煮1h，过滤。合并3次滤液并进行浓缩，使中药的终浓度为1g／mL，高压灭菌后冷藏备用。

1.2.3 中药提取物和抗菌药最小抑菌浓度的测定

参照CLSI（2008）［11］推荐的微量二倍稀释法测定各药物对分离到细菌的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concertration，MIC），并对结果进行判定该菌是否耐药。

1.2.4 耐药菌fosA3型和ESBLs型基因的检测

1.2.4.1 引物合成 根据GenBank登录的基因序列，设计fosA3 和ESBLs亚型引物：fosA3 上游引物：5′－GCGTCAAGCCTGGCATTT－3′；fosA3 下游引物：3′－GCCGTCAGGGTCGAGAAA－5′。TEM上游引物：5′－AGGAAGAGTATGATTCAACA－3′；TEM 下 游 引 物：5′－CTCGTCGTTTGGTATGGC－3′。CTX－M 上 游 引 物：5′－GGGCTGAGATGGTGACAAAGAG－3′；CTX－M 下 游 引 物：5′－CGTGCGAGTTCGATTTATTCAAC－3′。SHV 上游引物：5′－GGTTATGCGTTATATTCGCCTGTG－3′；SHV 下 游 引 物：5′－TTAGCGTTGCCAGTGCTCGATCA－3′。以上引物全部由由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成。

1.2.4.2 反应体系 50μL 反应体系：模板DNA 2μL，Taq 酶0.5μL，dNTP 4μL，buffer 5μL，上游、下游引物各2μL，去离子水34.5μL。不同类型和亚型基因的退火温度为：fosA3（55℃）、TEM（52℃）、SHV（57℃）、CTX－M（55℃），设阴性对照，PCR 扩增产物经10g／L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外投射仪下观察结果并用凝胶成像系统摄像。

1.2.5 中药水提物与抗菌药联合诱导抑制试验以含有亚抑菌浓度的白头翁水提取物的MH 肉汤作为培养基，联合各抗菌药传代培养3次，采用常规2倍微量测定中西药联合对耐药菌的MIC，观测被中药作用3代后细菌对抗菌药MIC的变化。

2 结果

2.1 细菌分离鉴定结果

细菌纯化培养后，该菌在麦康凯平板上为玫瑰红色、圆形、表面光滑的菌落，在SS琼脂平板上为红色菌落（图1）；将纯化后的细菌接种生化培养鉴定管鉴定，确定为大肠埃希菌。

2.2 PCR 扩增结果

琼脂糖凝胶电泳结果显示，该菌同时含有3个耐药基因分别为fosA3型、TEM 型和CTX－M 型，见图2。由生工生物工程（上海）股份有限公司测序，结果表明，TEM 型扩增产物碱基的长度为521 bp，CTX－M 型扩增产物碱基的长度为876bp，fosA3扩增产物碱基的长度为258bp。

图1 细菌在不同培养基上的生长Fig.1 Growth of colonies in different medium

2.3 单药最小抑菌浓度测定结果及中西联合作用细菌结果

白头翁水提取物MIC 大于0.5g／mL。结果表明：各抗菌药的单药MIC 值较高（表1），根据CLSI（2010）判断标准可判定该菌对各抗菌药均表现为耐药。中西联合作用3代后，中药可明显降低各抗菌药的MIC值，头孢曲松钠、阿莫西林、头孢他啶、头孢噻呋钠、氟苯尼考从第1代就开始降低。

结果表明，以亚抑菌浓度白头翁水提取物联合抗菌药对耐药菌作用3 代，可使其MIC 值明显降低，上述白头翁水提取物对含fosA3型、TEM 型和CTX－M 型耐药基因的大肠埃希菌对各抗菌药的MIC均降低到原来1／4以下，根据标准可判断白头翁水提取物对耐药大肠埃希菌具有较好的耐药逆转作用，白头翁联合抗菌药可对耐药大肠埃希菌感染的疾病进行较好的治疗。

表1 抗菌药单药MIC和白头翁水提物与抗菌药联合作用的MIC（μg／mL）Table 1 The MIC of antimicrobials and Pulsatilla chinensis water extract combination with antimicrobials

3 讨论

白头翁始载于《神农本草经》，药用部位为其根。白头翁根的主要有效成分为三萜皂苷、三萜酸、木脂素、胡萝卜苷以及糖蛋白等成分［12］。现代研究表明白头翁素具有显著的抗菌消炎和增强免疫功能的作用，可减轻肠道黏膜损伤并加速肠黏膜的修复［13］。白头翁治疗大肠埃希菌的研究报道也不少，有文献报道白头翁散对耐热肠毒素大肠杆菌病治愈率为86%，效果显著［14］，方向红报道白头翁的水提物抗猪大肠埃希菌效果不错［15］，李文超等［16］采用不同的溶媒对白头翁进行提取，发现不同溶剂的提取物的都有抗菌效果，但作用效果差异不明显。本试验采用水煮液，也发现白头翁对耐药菌具有一定的抑制作用，与文献报道白头翁对大肠埃希菌具有一定的抑菌作用报道一致。

目前中药具有耐药逆转作用的报道文献也较多，并且不同的中药具有耐药逆转的机理不同。中药主要是通过以下机理实现耐药逆转作用：①中药消除R 质粒［17］；②中药抑制β－内酰胺酶。细菌产生β－内酰胺酶可以水解β－内酰胺环类药物，尤其产生的ESBLs［18］；③中药影响细菌的生长速度和蛋白表达量，进而改变细菌的耐药性［19－20］；④中药对耐药细菌外排泵抑制作用［21－22］。本次试验通过白头翁水提取物连续诱导含3种耐药基因的大肠埃希菌，发现被中药提取物作用后的耐药菌对常见抗菌药的MIC明显降低，且降低到原来MIC 的1／4以下，说明白头翁可让耐药大肠埃希菌对该试验中用到的抗菌药具有耐药逆转作用，至于其作用机理有待进一步研究。综上所述，采用白头翁水提取物联合抗菌药可以作为一种治疗同时含fosA3 型、TEM 型和CTX－M 型耐药基因的大肠埃希菌感染疾病的较好方案，可以用于临床推广。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典第一部［S］.北京：化学工业出版社，2000：78.

［2］ 江苏新医学院.中药大词典（上册）［M］.上海：上海科技出版社，1977：704.

［3］ 郭永和，刘永春，秦 剑.11种中药体外灭阴道毛滴虫［J］.时珍国医国药，2000，11（4）：297.

［4］ Yao D C，A thanasios G，Lessidis V，et al.Chemilum ineseence detection of superoxide an ion release and superoxide dismutase activity：modulation effect of Pulsatilla chinensis［J］.Analy Bioanaly Chem，2004，379（1）：171－177.

［5］ 刘钟杰，许剑琴.中兽医学［M］.北京：中国农业出版社，2009：171.

［6］ 姜峰玉，陈定法，孙 抒.白头翁的研究现状和临床应用［J］.医学综述，2009，15（24）：3785－3787.

［7］ 岳文华，徐 坤，冯育林，等.白头翁皂苷D 体外抗肝癌作用及其机制研究［J］.中草药，2014，45（2），3295－3301.

［8］ 陈岩勤，张庆远，李笑然，等.白头翁总皂苷对体外培养的日本血吸虫幼虫及成虫的作用［J］.中国血吸虫病防治杂志，2013，25（6）：604－609.

［9］ Hou J，Huang X，Deng Y，et al.Dissemination of the fosfomycin resistance gene fosA3 with CTX－M b－lactamase genes and rmtB carried on IncFII plasmids among E.coli isolates from pets in China［J］.Antimicrob Agent Chemother，2012，56（4）：2135－2138.

［10］ Hou J X，Yang X Y，Zeng Z L，et al.Detection of the plasmid－encoded fosfomycin resistance gene fosA3in E.coli of food－animal origin［J］.J Antimicrob Chemother，2013，68：766－770.

［11］ Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated From Animals－Third Edition：Approved Standard M31－A3［S］.CLSI，Wayne，PA，USA，2008.

［12］ 陈振华，管咏梅，杨世林，等.白头翁研究进展［J］.中成药，2014，36（11）：2380－2383.

［13］ 徐倩倩，马利芹，张晓利，等.白头翁素对PRV、E.coli混合感染性腹泻肠道超微结构的影响［J］.中国农学通报，2010，26（19）：13－17.

［14］ 孔春梅，刘小宝，穆 祥，等.白头翁散对鸡耐热肠毒素大肠杆菌病的疗效观察及其机理研究［R］.第五届中国蛋鸡行业发展大会会刊，2011：170－172.

［15］ 方向红，王永娟，抗猪大肠杆菌病中药的筛选和效果研究［J］.西南农业学报，2013，26（4）：1744－1746.

［16］ 李文超，时维静，顾有方，等.白头翁不同提取物抑菌作用研究［J］.中兽医医药杂志2011（2）：38－40.

［17］ 杨 奇，舒 刚，马 驰，等.单味中药对3种细菌R 质粒消除作用的研究［J］.黑龙江畜牧兽医，2014，10（19）：154－157.

［18］ 石 科，贾艳华，吴 华，等.对超广谱β－内酰胺酶有抑制作用的中药的筛选［J］.中国畜牧兽医，2008，35（3）：83－85.

［19］ Humphery S I，Hecker M.Microbial Proteomics：Functional Biology of Whole Organisms［M］.Chemical Industry Press，2009：11－12.

［20］ 房春林.杨树花及其复方制剂药学与临床应用研究［D］.四川雅安：四川农业大学博士学位论文，2010.

［21］ Stermitz F R，Seriven L N，Tegos G，et al.Two flavonols fromArtemisa annua which potentiate the activity of berberine and norfloxacin against a resistant strain of Staphylococcus aureus［J］.Planta Med，2002，68（12）：1140－1142.

［22］ 杨凤春，任爱民，王 红，等.中药对多重耐药鲍曼不动杆菌外排泵抑制作用的研究［R］.中华医学会第十次全国临床微生物学术年会暨第九届全球华人临床微生物与感染症学术论坛暨2013年浙江省医学微生物与免疫学及医学病毒学学术年会论文汇编.