周连宁，王 波，吴 锋，赵振业，梅立永

（1.深圳市深港产学研环保工程技术股份有限公司，广东深圳518057；2.深港产学研基地，广东深圳 518057）

培养条件对小球藻生长及油脂积累的影响研究

周连宁1,2，王 波1，吴 锋1，赵振业1,2，梅立永1

（1.深圳市深港产学研环保工程技术股份有限公司，广东深圳518057；2.深港产学研基地，广东深圳 518057）

随着化石能源枯竭，微藻生物柴油日益成为研究热点，不同的培养条件对小球藻的生长及油脂积累有很大的影响。因此考察了温度、光强和水体pH值等因素对小球藻的生长及油脂积累的影响。结果表明，不同温度下小球藻的生长情况和油脂含量不同。在25℃时，小球藻细胞密度最大，油脂积累量最高，达到了26.50%±4%；光照强度对小球藻生长及油脂积累也有很大影响，5000 lux时小球藻细胞密度最大，油脂含量最高；同时pH值对小球藻生长及油脂积累也有显著作用，在pH值为7时小球藻细胞密度和油脂积累量最大，其中油脂积累量为（23.96±4.3）%。

培养条件；小球藻；油脂含量

当前，随着化石燃料日益减少，环境污染日益严重所引发的能源危机与环境问题迫使人们不断去寻找一种新型可再生能源。而由微藻为原料制取的第3代生物柴油，由于其不占用耕地，微藻生长繁殖速度快，油脂含量高还可用于污水治理等优点，引起了全球科学家广泛的关注［1］。其中小球藻(Chlorella)是分布广泛的单细胞绿藻。因其富含藻多糖、脂肪酸、糖蛋白和维生素等营养成分,不仅可以作为保健品食用［2］，而且可以作为生物柴油的原料，关于微藻生物柴油的研究已经有很多［3］。

微藻生长不仅与藻种自身的生理特性相关，还受到生长环境的制约，其中影响较大的是温度、pH值以及光照强度。为了获得较高的油脂收获率，我们就需要对小球藻的生长条件进行优化，以期获得最大的生物量以及油脂含量。国内外关于相关环境因子对小球藻生长影响的报道很多，Hultberg等人［4］研究发现不同光照强度对小球藻的生长有很大影响，Ma等人［5］研究了不同温度下小球藻的油脂含量，发现小球藻的最佳培养温度在25℃～30℃之间，王俊彩等人［6］对小球藻的培养条件和油脂积累特征进行了研究，发现在pH值6.5～8.5之间小球藻生长情况跟油脂积累并无太大差异。而本文主要在前人的研究结果的基础上，进一步对小球藻生长和油脂积累的影响因子分别进行考察，主要涉及温度、pH以及光照强度，旨在为利用污水高效培养小球藻的条件优化提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

小球藻（Chlorella vulgaris）（菌株编号：FACHB-8，藻种保藏号：cgmcc Nol448），培养基主要利用豆制品废水（取自深圳维他（光明）食品饮料有限公司），经过一定处理和高温灭菌后各项指标如下：化学需氧量（CODcr）为（1011±26.87）mg/L、总氮（TN）为（33.55± 1.2）mg/L、总磷（TP）为（3.57±0.18）mg/L、铵态氮（-N）为（7.24±0.76）mg/L、硝态氮（-N）为（3.35±0.21）mg/L、五价磷（P-P）为（2.25±0.1）mg/ L、pH值为（8.8±0.28）。

1.2实验方法

1.2.1藻干重测定

取预先烘干并称重的2.5m L离心管，加入约2m L藻液置于离心机内。调整转速为10000 r/min，离心2 min。随后弃掉上清液，加入约2m L去离子水后置于振荡器上震荡15 s至重新悬浮。然后再次离心，弃去上清液，以上过程重复3次。最后将离心管敞口置于80℃烘箱中烘至恒重，测定干重。每组设置3个平行实验，最终结果取平均值。

1.2.2小球藻细胞密度测定

由于在液体中小球藻密度和其吸光度成一定的比例关系，因此可利用分光光度计，在680 nm波长下对藻液进行D680nm值测定，每组设置3个平行实验，最终结果得平均值来定性测定藻细胞密度并反映其生长情况。

1.2.3油脂含量的测定

测定方法采用干重法，设置3个平行实验，最终结果取平均值。称取一定质量的藻粉研磨破碎后放入离心管，随后加入氯仿∶甲醇∶蒸馏水=1∶1∶0.9混合溶剂持续震荡1 h后离心去上清液，重复2次后静置。静置分层后取下层氯仿层于60℃条件下至恒重，即得到油脂。油脂含量的计算公式为：

总脂百分含量=（总脂重/干藻重）×100%

1.2.4小球藻培养方法

取50m L小球藻藻液接种至500m L已灭菌的污水培养液，包扎好后置于光暗比为12 L∶12 D的光照培养箱中培养10 d，定期摇瓶。

1.2.5单因素实验方案设定

温度设定为15℃、20℃、25℃、30℃和35℃5个梯度；培养光强为（5000±100）lx；培养液为污水原液。

光强设定为2500、5000、7500和10000 lx 4个梯度。培养温度为25℃；培养液为污水原液。

pH值设定为3、5、7、9和11共5个梯度；利用盐酸和氢氧化钠来调节不同pH值的污水培养液。培养温度为25℃，光强为（5000±100）lx。

以上实验均做3个对照试验组，最终数据取3组的平均值。

2 结果与分析

2.1温度对小球藻生长及油脂积累的影响

温度对小球藻生长的影响。由图1可见：小球藻在15℃～35℃范围内都能生长，但是温度对小球藻生长速率有显著影响，在15℃～25℃范围内，随着温度的不断升高，小球藻的生长速率及总量也随之增大，但我们发现在25℃～35℃范围内随着温度的升高而其生长速率及生物总量反而随之降低，在实验的温度范围内，生长速率及生物总量总体呈现出一种先升高后降低的趋势。并且在35℃条件下，培养到第11天时，小球藻生长速率出现负值，说明小球藻不适宜在较高温度下长时间培养。培养至第5天时，温度为15℃、20℃条件下的实验组小球藻细胞密度极显著低于其他实验组，说明小球藻在较低温度下适应环境的时间较长，延时期增加。

温度对小球藻油脂积累的影响。图2所示为不同温度条件下小球藻细胞内的油脂积累量的变化情况，从图中我们可以看出，温度对小球藻细胞内油脂积累量有显著影响，在15℃～25℃范围内，其油脂含量随温度的升高而增加；而在25℃～35℃范围内小球藻的油脂含量随温度的升高而降低，在实验的温度范围内，整体呈现先增高后降低的趋势，并且在温度为25℃时小球藻细胞内油脂含量达到最大值为26.50%±4%，其结果与对小球藻生长的影响相吻合。

图1 不同温度下小球藻的细胞密度Fig 1 Chlorella celldensity atdifferent temperatures

图2 不同温度下小球藻细胞内的油脂积累量Fig 2 Chlorella intracellular accumulation of fatatdifferent temperatures

2.2光照强度对小球藻生长及油脂积累的影响

光照强度对小球藻生长的影响。光照强度是影响小球藻生长和油脂积累的重要因素，因此本实验考察了不同光照条件下小球藻的生长情况，如图3所示。

图3 不同光照条件下小球藻的生长情况Fig 3 Chlorella grow th under different lighting conditions

从图中我们可以看出光照强度不同，小球藻的生长情况也不同，光照强度对小球藻生长有显著影响。在光照强度为2500～10000 lx条件下，小球藻都能生长，并且在较低光强下，小球藻的生长速率随光照强度的增加而增大，当光照强度增加到5000 lx时小球藻细胞密度达最大值，继续增大光照强度小球藻生长速率不再增加并且开始出现下降趋势，在设定的光强范围内，小球藻的生长速率整体呈现先上升后下降的趋势。在光强为2500和10000 lx条件下，小球藻的生长速率和总量都显著低于其他实验组，说明光强过低或过高都不利于小球藻的生长。

光照强度对小球藻油脂积累的影响。光照强度不仅影响小球藻的生长情况，而且对细胞内油脂含量也有显著影响。从图4可以看出：不同光照强度下，小球藻细胞内的油脂含量也不同，在2500～5000 lx范围内，随光照强度的增大小球藻细胞内油脂含量也在增加，在5000～10000 lx范围内，油脂积累量随光照强度的增大而降低，在实验范围内整体呈现先增高后降低的趋势，并且在5000 lx是油脂含量最高，达25.68%±2%；在10000 lx时油脂积累量最低，为12.63%±1.1%。

图4 不同光照强度下小球藻细胞内油脂积累量Fig 4 Accumulation of fatw ithin the chlorella cells under different light intensities

2.3 pH对小球藻生长及油脂积累的影响

培养液pH值对小球藻油生长的影响。从图5可以看出：小球藻在强酸(pH值3)或强碱(pH值11)条件下基本不能生长，但是随着培养天数的增加，当培养液pH变为适宜小球藻生长值时，小球藻开始迅速增长；在pH值为5～9的范围内，小球藻都能进行良好的生长，并且在第11天时，其生长速率随pH值的增高而增加，在培养期结束时(25 d)，随着pH值的升高，小球藻的细胞密度先增大后减小。在实验范围内，小球藻生长的整体趋势为：随着pH值的升高，小球藻细胞密度先增大后减小，并且经过多重比较，pH值为7时的细胞密度最大，培养结束时D680nm值为4.38。

在pH值3和pH值11条件下小球藻不能生长的主要原因可能是由于强酸、强碱的条件下影响了营养物质的矿化程度，或者改变了细胞膜表面的电荷分布，甚至会出现质壁分离的情况。杨勋［12］等人考察了不同pH值对小球藻生长的影响，发现在pH值6.5～9.5范围内小球藻可以进行生长，最佳pH值8，王翠等［13］利用沼液培养小球藻，考察了不同pH值对其影响，发现最佳pH值7，最佳pH值的不同可能是由于所选藻株不同造成的。

培养液pH值对小球藻油脂积累的影响。通过研究不同pH值对小球藻生长情况的影响，发现小球藻在pH值3和pH值9条件下基本不能生长，因此本实验只考察了在pH值5～9范围内小球藻细胞内油脂积累的情况。由图6可以看出：培养液pH值的改变对小球藻细胞内油脂积累有显著影响，并且随着pH值的升高，油脂含量呈现先增大后减小的趋势，在pH值7时取得最大值23.96%±4.3%，与不同pH值条件下小球藻的生长情况相一致；在pH值5时油脂含量为17.35%± 2.1%，在pH值9时油脂含量为19.72%±2.4%，说明小球藻在碱性环境中油脂积累量要高于酸性环境，小球藻耐碱性强于耐酸性。

图5 不同pH值下小球藻的生长情况Fig 5 grow th of Chlorella atdifferentpH

图6 不同pH值条件下小球藻油脂积累情况Fig 6 Chlorella greaseaccumulation atdifferentpH conditions

3 讨论

本实验研究了不同温度、光照强度、pH值条件下小球藻生长和油脂积累情况。

小球藻在25℃～30℃范围内比较适宜生长，最佳生长温度为25℃。在实验的温度范围内，生长速率及生物总量总体呈现出一种先升高后降低的趋势。在35℃条件下，培养到第11天时，小球藻生长速率出现负值，说明小球藻不适宜在较高温度下长时间培养。并且温度为15℃条件下的实验组小球藻细胞密度极显著低于其他实验组，说明小球藻在较低温度下生长缓慢。研究表明，温度对小球藻生长的影响主要是通过影响酶的活性和营养物质的运输实现，温度较低时,细胞膜的运输和呼吸代谢功能会受到影响，生长速率较慢；但随着逐渐温度上升,酶活性不断增强,生长速率也逐步加快；而当温度过高时，可能会破坏细胞和酶的活性，导致生长速率降低甚至出现负增长。通过实验结果可以看出，小球藻的最佳培养温度为25℃，这与刘加慧等［7］人的研究结果相一致。

随着温度的升高，小球藻油脂含量呈现先增高后降低的趋势，并且在温度为25℃时小球藻细胞内油脂含量达到最大值。油脂含量出现上述变化趋势的主要原因可能是温度对参与光合作用的酶产生了相应作用，小球藻细胞内油脂的积累始于光合作用，当温度过低时细胞体内的酶活性较弱，活性中心数量较少，随着温度的升高小球藻体内的酶活性也逐步升高，但是当温度过高时会对其产生不可逆的结构破坏，造成酶数量减少。丁彦聪［8］等人研究了温度对小球藻细胞内叶绿素荧光参数的影响，结果表明温度过高会使活性反应中心的数量下降，进而捕获和用于电子传递的能量减少，造成油脂积累量下降。张桂艳［9］等人研究了温度对小球藻油脂积累量的影响，其研究也呈现出先上升后下降的趋势，并且在35℃左右取得最大值，这可能是由于所选的小球藻品种不同造成的差异。

小球藻的光合作用能力是其他高等植物的10倍左右，鉴于这种生命活力，小球藻被人们亲切的赞美为“罐装的太阳”。因此研究光照条件对小球藻生长和油脂积累的影响是必要的。研究发现，不同光照条件下小球藻的生长趋势和油脂积累情况呈现先升高后降低的趋势，小球藻最佳光照强度为5000 lx。这是由于光照强度影响了小球藻的光合作用速率，研究表明［10］当光照强度在光饱和点以下时，微藻的光合作用随着光照强度的增加而加强，从而促进藻细胞的生长；超过光饱和点时，藻类的光合速率不再增加，甚至减弱、停止。刘青［11］等人研究了不同光照强度下小球藻的生长情况，也是呈现出先增高后降低的趋势，并且在5000 lx时取得最大值，与本实验结果相同。当光强较低时，抑制细胞生长和油脂积累的因素主要是光强，因此随着光照强度的增加，细胞光合作用速率加快，细胞内油脂积累较多，当达到一定值时，光强不再成为限制因素，如果继续增大光强反而会对细胞结构产生破坏，造成油脂含量降低。实验结果说明在小球藻的培养过程中并不是光照强度越大越好，相反较大的光照强度反而会降低细胞内的油脂含量，因此光照强度要控制在合适的范围内。

小球藻在pH值为5～9的范围内，小球藻都能进行良好的生长；在强酸(pH值3)或强碱(pH值11)条件下基本不能生长，但是随着培养天数的增加，培养液的pH逐渐变为适宜小球藻生长，小球藻开始迅速增长。可能是由于强酸、强碱的条件下影响了营养物质的矿化程度，或者改变了细胞膜表面的电荷分布，甚至会出现质壁分离的情况。杨勋等［12］人发现在pH值6.5～9.5范围内小球藻可以进行生长，最佳pH值8。王翠等［13］利用沼液培养小球藻，发现最佳pH值7，可能是由于所选藻株不同造成最佳pH值的不同。

本研究发现培养液pH值的改变对小球藻细胞内油脂积累有显著影响，在pH值7时取得最大值。pH值对微藻细胞油脂积累的影响主要在于改变细胞膜电荷和营养物的离子化程度，进而改变细胞内酶的活性和细胞对营养离子的吸收，例如光合作用中CO2的吸收，呼吸作用中对有机碳源的利用效率，细胞代谢产物的再次利用及其毒性。有研究表明［14］微藻体内酶的最适pH值为7.5～8.0左右，在pH值7.5～8.0条件下，有关酶能很好地发挥作用,使不饱和度增加，多不饱和脂肪酸含量增加，在其它pH值时，多不饱和脂肪酸含量相对较低。王晓晨等人［15］研究了不同pH值条件下小球藻细胞内的油脂积累情况，发现在pH值8时油脂积累量最大，不同研究的最佳pH值不一致的原因可能有以下两个：选择的小球藻品种不同；小球藻的培养环境或者营养元素的配比不同。

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The im pactof different culture conditionson the chlorella’s grow th and fataccumulation

ZHOU Lian-ning1,2,WANG Bo1,WU Feng1,ZHAO Zhen-ye1,2,MEILi-yong1
(1.Shenzhen-Hongkong Institution of Industry,Education&Research Environmental Technique Co.,Ltd.,Shenzhen 518057;2.PKU-HKUSTShenzhen-Hongkong Institution,Shenzhen 518057,China)

With the depletion of fossil fuels,algae biodiesel increasingly become a hot topic,and a different culture conditions have a great impacton the grow th and fataccumulation of Chlorella.Therefore,this paper exam ined the impactof factors such as temperature,light intensity,and water pH on the Chlorella’sgrow th and fataccumulation.The results showed that Chlorella’s grow th atdifferent temperatures have different fataccumulation.At25℃,Chlorella cells reached the highest density,and the highestaccumulation of grease could reach to(26.50±4)%;light intensity also had a great impact on Chlorella’s grow th and grease accumulation, and Chlorella themaximum cell density,highest fat content appeared at 5000 lux;pH also have a significant role in the grow th of Chlorella and fataccumulation,when pH=7,the Chlorella cells reached to the highestdensity and the highestaccumulation of greasereached to(23.94±4.3)%.

culture conditions;chlorella;fatcontent

S968.49;Q949.2

A

2095－1736（2015）03－0046－05

10.3969/j.issn.2095-1736.2015.03.046

2014-10-17；

2014-11-18

深圳市战略新兴产业发展专项资金项目（CXZZ20120618111150009）；青年科学基金项目（513080061006239）

周连宁，硕士，主要研究方向为环境生物技术，E-mail：z.l.ning@163.com。