林恒州 张猛 陈保东 黄贤键 张秋生 纪涛 何毅 李维平

·基础研究·

大鼠中度液压颅脑损伤后氧化应激反应实验研究

林恒州1,2张猛2陈保东2黄贤键2张秋生2纪涛2何毅2李维平2

目的探讨中度颅脑液压损伤(TBI)大鼠模型生化指标脂质氧化终产物丙二醛(MDA)及抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)含量相关指标的变化，并探讨其与继发性脑损伤间的关系。方 法将雄 性 Sprague-Daw ley 大 鼠 48 只 按 随 机 数 字 表 法 分 成 中 度 颅 脑 损 伤(mTBI)组 和 假 手 术(Sham-TBI)组 ，每 组 24 只 。 以 液 压 中 度 TBI指 标 致 伤 mTBI组 ，并 于 伤 后 6 h、24 h 处 死 大 鼠 ，通 过ELISA免疫酶技术测定抗氧化剂GSH和脂质氧化产物MDA在2组的不同表达，评价大鼠颅脑创伤后的氧化应激损伤。应用 SPSS 19.0统计软件，对两组的 GSH和MDA浓度比较采用独立样本 t检验。结果m TBI组脑组织见挫伤灶及蛛网膜下腔出血，HE染色后可见神经元损伤核固缩，细 胞 坏 死 呈 空 泡 状 ，而 Sham-TBI组 未 见 神 经 元 损 伤 表 现 。TBI后 m TBI组 中 的 MDA 浓 度 较Sham-TBI组显 著升高[6 h 时分别为(8.34±2.03)μg/g 和(3.92±1.20)μg/g，t=6.493，P=0.000]，随 伤 后时 间 的延长 ，MDA 的 浓度显 著 升 高[24 h 时分 别 为(12.74±2.44)μg/g 和(3.96±1.18)μg/g，t=11.222，P=0.000]；而 TBI后 mTBI组 GSH 浓 度 显 著 低 于 Sham-TBI组 [6 h 时 分 别 为 (2.65 ± 0.63)μg/g 和(4.90 ± 0.56)μg/g，t=9.247，P=0.000]，随 伤 后 时 间 的 延 长 ，GSH 的 浓 度 显 著 降 低 [24 h 时 分 别 为(2.20±0.62)μg/g 和(4.88±0.55)μg/g；t=11.202，P=0.000]。结论液压 TBI模型致伤能量能够测量，中度闭合性颅脑外伤可导致脑组织病理学改变和氧化应激损伤，且氧化应激损伤指标与脑损伤时间呈正相关，外伤后早期阻断氧化应激过程可能起到脑保护作用。

颅 脑 损 伤 ； 创 伤 学； Sprague-Daw ley 大鼠； 氧化 性 应 激 ； 丙 二醛； 谷胱甘肽

颅 脑 损 伤(traumatic brain injuries，TBI)后 ，继 发性损伤对组织的破坏性往往较原发性损伤更为广泛和严重，由自由基及脂质过氧化引起的氧化应激损伤是继发性损伤中已经被广泛认同的病理生理机制之一。TBI后机体短时间内即可迅速产生大量的自由基，主要表现为对各种生物大分子的攻击，造成了机体严重的损害。本实验采用大鼠液压中度闭合性TBI模型，具有良好稳定性及重复性，为后继研究提供实验基础，同时观察TBI后机体病理学及氧自由基改变。

材料与方法

一、实验动物

雄 性 Sprague-Daw ley 大 鼠 共 48 只 ，体 重 均 为250～280 g；由中山医科大学动物实验中心提供，大鼠按照随机数字表法分为两组：中度损伤组(m TBI，24 只)，假损伤组(Sham-TBI组，24 只)。所有大鼠的饲养和实验方案都遵从于国家实验动物中心制定的实验动物管理条例，并且获得了深圳巿第二人民医院动物实验中心审批。实验大鼠于动物室分笼饲养，室内温度 22～25℃、湿度(55±5)%、明暗交替光照 环 境(12 h/12 h)，投 清 洁 级 标 准 颗 粒 饲 料 ，自 由 饮用清洁用水。本实验所涉及动物的处理均经过深圳市第二人民医院伦理委员会批准。

二、仪器

液压脑损伤打击仪由美国维珍尼亚大学医学院生物医学工程部制造。液压装置由圆形液柱(长60 cm，直 径 为 41.5 cm)、电打 击 架 、示 波 器 和 压 力 传感器组成。圆形液柱是一个水平放置，内装满37℃生理盐水密封的聚乙烯有机玻璃圆筒，圆筒内的一端是用橡皮全覆盖的有机玻璃活塞，另一端接打击管和压力传感器，并连接一个内径为2.6mm的圆形向外开口，此开口连接大鼠的硬脑膜。液压是通过一个金属摆锤打击活塞后产生的压力，引起少量生理盐水短暂向一端移动，通过打击管内的液体传导到颅腔，作用于颅内组织，造成脑损伤，压力传感器记录此脉冲式压力并通过示波器显示测量压力的峰值，用大气压(atm)来表示。通过调整摆锤的高度来调节压力大小。本实验致伤压力(1.5±0.2)atm。外置压力传感器示波器；68001动物脑立体定向仪(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；小动物呼吸麻醉机(RWD407/510F 型号，深圳瑞沃德生命科技有限公司)；G3F 多参数监护仪(深圳杰纳瑞生命科技有限公司)；液压伤打击连接头(由 50m l注射器头端切割出，保留塑料部分，内径约 2.6mm)；手术显微镜(LH-1 型号，徐州利华电子科技发展有限公司)；固定螺钉(植入于颅骨上，用于固定打击管，直径为0.8mm，长度为 5mm)；脑温仪(MDP-80 型号，美国加利福尼亚州斯坦福大学Omega工程研究院)。

三、试剂

100 g/L 水合氯醛(深 圳 巿 儿 童医院制剂室)；大鼠丙二醛(malondialdehyde，MDA)ELISA 检测试剂盒，大鼠 谷胱甘肽(glutathione，GSH)ELISA 检测试剂盒；戊巴比妥(上海江莱生物科技有限公司)；多聚甲醛(天津博迪化工股份有限公司)；蔗糖(天津博迪化工股份有限公司)。

四、实验动物分组及处理

大鼠按照分组制作m TBI模型，各组在接受液压致伤前24 h进行手术埋入液压致伤连接管，mTBI组接受(1.5±0.2)atm 压力的液压伤，而 Sham-TBI组则行与m TBI组所有相同的麻醉和手术，不做液压损伤。处理后按上述所提供条件饲养，分别于致伤后6 h、24 h随机处死，每个时间段每组均处死6只。

五、脑标本采集和切片

大鼠 在 各 预设的 时 间 点用 100 g/L 水 合 氯 醛腹腔注射麻醉(300mg/kg)后，立即紧贴枕骨孔处离断鼠头，用小咬骨钳沿枕骨大孔起逐块咬除枕、顶、额骨，离断颅底神经，取出全脑组织，标本取样在脑损伤灶区，标本脑组织浸入40 g/L多聚甲醛内于4℃固定48 h后，再修成厚4mm块状，常规用酒精脱水，石腊包埋，作5 μm冠状切片，行HE染色，显微镜下观察。拟进行生化指标脂质过氧化产物MDA及抗氧化剂GSH及检测的大鼠，经左心室穿刺插管快速灌注 200m l冷冻生理盐水(4℃)后，立即断头取脑。

六、大鼠MDA、GSH检测

mTBI组及 Sham-TBI组脑组织标本取出后准确称重，各加入适量生理盐水，在冰浴中用电动搅拌 机 制 成 脑 组 织 匀 浆 ，低 温 高 速(离 心 半 径 5 cm，3 000 r/m in，4℃)离心 10m in 后取上清液 1m l。采用ELISA 法检测。在 Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应吸光度(A)值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

七、统计学分析

两组的 GSH 和 MDA 浓度以均数±标准差(x±s)表 示 ，应 用 SPSS 19.0 统 计 软 件 对 不 同 时 间 点 采 用独立样本t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

一、HE染色后光镜观察

m TBI组HE染色后观察，脑实质内见出血，神经元损伤核固缩，细胞坏死呈空泡状，神经胶质细胞及组织间隙水肿，出血灶周边血管有扩张，水肿带可见中性粒细胞积聚(图 1A)。

Sham-TBI组HE染色后观察，脑细胞染色均匀，无肿胀，无充血及出血灶，脑组织结构正常，脑血管无扩张，未见炎性细胞浸润(图 1B)。

二 、ELISA检 测 致 伤 后 6 h、24 h大 鼠 脑 组 织 中MDA及GSH结果

根据标准品说明书配置不同浓度的样品(表 1)，测量 A450后，绘制MDA 及 GSH 标准曲线(图 2、3)。

MDA 检 测 结 果 显 示 ，6 h 时 m TBI组 为(8.34±2.03)μg/g，Sham-TBI组为(3.92±1.20)μg/g，差异 有 统 计 学 意 义(t=6.493，P=0.000) ；24 h 时 m TBI组 为 (12.74 ± 2.44)μg/g，Sham-TBI组 为 (3.96 ± 1.18) μg/g，差异有统计学意义，(t=11.222，P=0.000，图 4)。

图1 脑损伤大鼠脑组织病理切片(HE染色 ×50)Fig.1 Pathologic section of brain tissue of craniocerebral injury rats,HE staining

表1 不同浓度MDA及GSH的标准曲线数据Tab.1 Standard curve dataofMDA and GSH in differentconsistency

GSH 检 测 结 果 显 示 ，6 h 时 m TBI 组 为(2.65±0.63)μg/g，Sham-TBI组为(4.90±0.56)μg/g，差异有统计学意义(t=9.247，P=0.000)；24 h 时 mTBI组为(2.20±0.62)μg/g，Sham-TBI组为(4.88±0.55)μg/g，差异有统计学意义(t=11.202，P=0.000，图 5)。

讨论

原发性TBI在医疗上不能干预，但随之而来的继发性脑损伤对脑组织的破坏性较原发性损伤更为广泛和严重[1]。氧化应激指机体在病理状态下，体 内 高 活 性 分 子 如 活 性 氧 自 由 基(reactive oxygen species，ROS)产生过多，氧化程度超出氧化物的清除水平，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。研究表明氧化应激在TBI的同时出现，也是 TBI后神经元、血管损伤的主要病理生理基础[2]。

图2 丙二醛标准品线性回归曲线Fig.2 Standard curve of malondialdehyde

图3 谷胱甘肽标准品线性回归曲线Fig.3 Standard curve of glutathione

图4 脑损伤大鼠MDA检测结果Fig.4 The resultsofMDA testof craniocerebral injury rats

图5 脑损伤大鼠GSH检测结果Fig.5 The resultsof GSH testof craniocerebral injury rats

中枢神经系统含有丰富脂质，对氧化应激反应非常敏感，脂质氧化后形成的活性羰基类物质主要是一些不饱和醛，这些活性羰基分子本身含有羰基，如：4-羟基壬烯醛、丙烯醛、MDA，这些活性羰基分子能与蛋白质侧链的组氨酸、赖氨酸、半胱氨酸等氨基酸的残基共价结合，从而造成蛋白质结构和功能的异常[3]。蛋白质羰基化能导致蛋白质功能的丧失和修饰蛋白质的水解[4]。动物实验中证实 TBI后脂质过氧化物的含量明显增加，羰基蛋白水平亦明显提高[5-6]。

本实验研究说明TBI后脂质氧化应激反应增强。TBI动物模型研究证实，使用抗氧化剂能够减轻创伤后继发 TBI[7]。GSH 含有的特异活泼巯基结构-SH，易被氧化脱氢，减少脂质过氧化物的产生，使其成为体内主要的自由基清除剂。TBI后脂质过氧化自由基反应增强，而由氧自由基介导脂质过氧化反应是引起继发性脑损伤加重的一个重要因素。

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Experimental study on oxidative stress in rats after moderate fluid-percussion brain injury

Lin Hengzhou1,2,Zhang Meng2,Chen Baodong2,Huang Xianjian2,Zhang Qiusheng2,Ji Tao2,He Yi2, LiWeiping2.1Guangzhou Medical University,Guangzhou 510182,China;2Department ofNeurosurgery,The Second People’sHospitalofShenzhen,Shenzhen 518037,China

LiWeiping,Email:Liweiping60@126.com

Objective To study the change of biochemical index ofmalondialdehyde(MDA) and glutathione(GSH)ofmoderate traumatic brain injury(TBI)ratsmodel,which are the end products of lipid oxidation and antioxidant,respectively.To explore the relationship between these two chemicals and secondary brain injury.Methods 48 adultmale Sprague-Daw ley ratswere random ly assigned to 2 groups:moderate-TBI(m TBI,n=24)group and sham-TBI(sham,n=24)group. Hydraulic moderate TBI index was induced to mTBIgroup.The rats were killed 6 h and 24 h after injured respectively,the levels of MDA and GSH were examined by ELISA enzymictechnology to analyze the different expression among 2 groups and to evaluate the oxidative stress injury of the rats after traumatic brain injury.The data was analyzed by SPSS 19.0 statistical analysis software,the concentration of GSH and MDA among 2 groupswas tested by independent-samples t Test.Results Brain contusion and subarachnoid hemorrhage could be observed in m TBI rats,in brain sectionsw ith HE staining,nuclear pyknosis and vesicular neurons could be detected.However,no similar injurycould be found in sham group.The concentration of MDA inmTBIgroup was significantly higher than that in sham group(in 6 h,level of mTBI 8.34 ± 2.03μg/g,level of sham 3.92 ± 1.20μg/g,t=6.493, P=0.000),and the concentration displayed a significantupregulated trend as timewentby post TBI(in 24 h,level of mTBI 12.74 ± 2.44μg/g,level of sham 3.96 ± 1.18μg/g,t=11.222,P=0.000).The concentration of GSH inm TBIgroup was significantly lower than that in sham group(in 6 h,level of m TBI 2.65 ± 0.63μg/g,level of sham 4.90 ± 0.56μg/g,t=9.247,P=0.000),and the concentration displayed a significant downtrend as time went by post TBI(in 24 h,level ofmTBI 2.20 ± 0.62μg/g, level of sham 4.88±0.55μg/g,t=11.202,P=0.000). Conclusions The injury level of hydraulic TBI model can be evaluated,moderate closed brain trauma resulted in brain tissue pathological changesand oxidative stress injury.The index of oxidative stresswas correlated w ith the injury period.Blockage of the process of the oxidative stress in the early stage post TBI may play an important role in neuroprotectiveeffect.

Traumatic brain injury; Traumatology; Sprague-Daw ley rats; Oxidative stress; Malondialdehyde; Glutathione

2014-12-01)

(本文编辑：杨艺)

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.01.003

深圳巿协同创新科技计划国际合作研究项目(20120608210932744)

510182 广州，广州医科大学1；518035 深圳，深圳巿第二人民医院神经外科2

李维平，Email：Liweiping60@126.com

林恒州,张猛,陈保东,等 .大鼠中度液压颅脑损伤后氧化应激反应实验研究[J/CD].中华神经创伤外科电子杂志,2015,1 (1):7-10.