梁存喜

基因工程和细胞工程是高考的重点，其中多处涉及到筛选问题，由于教材的介绍比较简略，很多学生对筛选的方法和原理不甚理解，在此结合具体的题目，对基因工程中目的基因和重组细胞的筛选以及细胞工程中杂种细胞的筛选进行分析，以期对学生的学习有所帮助.

一、基因工程中的筛选

1.利用DNA探针从基因文库中筛选目的基因

例1为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种.图1是获取植酸酶基因的流程.据图回答：

图1（1）图中基因组文库（小于/等于/大于）cDNA文库.（2）B过程需要的酶是；A、C过程中（可以/不可以）使用同一种探针筛选含目的基因的菌株.（3）目的基因Ⅰ和Ⅱ除从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中和为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是.

解析基因组文库是从酵母菌体内直接提取DNA构建的，cDNA文库是由酵母菌细胞中提取的mRNA经过逆转录而来的，由于酵母菌细胞内可能只有部分基因表达产生mRNA，因此基因组文库大于cDNA文库.B过程需要的酶是逆转录酶；因为A、C过程都能获得含目的基因的菌株，所以可以使用同一种探针进行筛选.目的基因Ⅰ和Ⅱ除从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中DNA和cDNA为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用的酶是耐高温的RNA聚合酶.

答案：（1）大于（2）逆转录酶可以

（3）DNAcDNA耐高温

知识链接基因文库包括基因组文库和cDNA文库.基因文库是一套包含特定生物体所有基因的DNA序列.其中，不同的DNA序列片段分别被克隆在适当的载体上.例如，人类基因文库是一群带有人类基因克隆的大肠杆菌细胞.那么我们如何从这个文库中筛选出所需要的目的基因呢？目前，有很多

图4（1）该放射性物质中被标记的元素是 .光合作用过程中，含标记元素的化合物被光反应提供的 还原成糖类.在适宜温度下测得叶片光饱和点，若其他条件不变，进一步提高温度，则该叶片光饱和点的变化是 .（2）由实验结果推断，幼铃脱落显著减少的是 组.B组幼铃放射性强度百分比最低，说明B组叶片的光合产物 .为优化实验设计，增设了D组（激素处理叶片），各组幼铃的放射性强度百分比由高到低排序是 .由此可知，正确使用该激素可改善光合产物调配，减少棉铃脱落.（3）若该激素不能促进插条生根，却可促进种子萌发和植株增高，其最可能是 .

答案：（1）碳；NADPH（[H]）；降低 （2）C；输出减少；C>A>B>D （3）赤霉素

创新之处考查了外源激素对植物光合产物调配的影响.

解析（1）光合产物用碳元素标记.光反应提供的[H]还原C3为糖类和C5.适宜温度下若提高温度，酶活性降低，光饱和点降低.（2）幼铃脱落是光合产物不足导致，C组幼铃中有机物占比最高，因而幼铃脱落显著减少.B组中叶片的放射性强度的百分比较高，说明有机物占比较多，输出较少.由题中数据可知，激素可抑制叶片有机物的输出，有利于幼铃有机物的输入，D组导致叶片有机物输出明显较少，且小于B组，因而幼铃的放射性强度百分比由高到低依次为C>A>B>D.（3）促进种子萌发和植株增高，但不能促进扦插枝条生根的激素，最可能是赤霉素.（收稿日期：2014-09-20）方法能够帮助我们从基因文库的众多克隆中筛选和鉴定带有特定基因的克隆，这些方法大多是以杂交探测技术为基础的.杂交探测是一种利用能和目的基因序列互补的DNA片段为探针，通过分子杂交的手段找出带有目的基因的DNA片段的实验方法.DNA探针是根据已知的有关目的基因的某些信息（部分DNA序列或蛋白质产物等）通过化学方法合成的核苷酸单链，制作DNA探针时，可利用目的基因的部分核苷酸序列，而无需使用全部的核苷酸序列， 因此虽然mRNA形成过程中存在加工过程，导致逆转录后获得的DNA可能和原DNA不完全相同，但仍可用同一种探针进行检测.探针要利用放射性元素或荧光色素进行标记以利于检测.

2.利用标记基因筛选重组细胞

例2目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图2-a所示.

图2（1）构建人工质粒时要有抗性基因，以便于.（2）现将pBR322质粒和目的基因经BamHⅠ处理后构建的重组质粒导入大肠杆菌细胞，为检测重组质粒是否导入原本无ampr和tetr的大肠杆菌体内，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图2-b的菌落.再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图2-c的结果（空圈表示与图2-b对照无菌落的位置）.与图2-c空圈相对应的图2-b中的菌落表现型是，图2-c的结果显示，多数大肠杆菌导入的是.

解析（1）构建人工质粒时要有抗性基因作为标记基因，以便于筛选（鉴别目的基因是否导入受体细胞）.（2）在含氨苄青霉素的培养基上培养，能够生长的大肠杆菌具有氨苄青霉素抗性基因，这些大肠杆菌中导入了pBR322质粒或重组pBR322质粒.经BamHⅠ处理后，pBR322质粒中的四环素抗性基因被破坏.因此在含四环素的培养基上培养，能够生长的大肠杆菌具有四环素抗性基因，这些大肠杆菌中导入了pBR322质粒而没有导入重组pBR322质粒.能在含氨苄青霉素的培养基上生长而不能在含四环素的培养基上生长的是导入了重组pBR322质粒的大肠杆菌，而既能在含氨苄青霉素的培养基上生长又能在含四环素的培养基上生长的只能是导入了pBR322质粒的大肠杆菌.综上分析可知，与图2-c空圈相对应的图2-b中的菌落是只能在含氨苄青霉素的培养基上生长而不能在含四环素的培养基上生长的大肠杆菌，表现型是能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素.图2-c的结果显示，多数大肠杆菌既能在含氨苄青霉素的培养基上生长，又能在含四环素的培养基上生长，导入的是pBR322质粒.

答案：（1）筛选（鉴别目的基因是否导入受体细胞） （2）能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素 pBR322质粒

知识链接用同种限制性核酸内切酶处理的目的基因和运载体具有相同的黏性末端，在DNA连接酶的作用下，如果只考虑两个DNA片段两两结合，混合物中至少有3种环状DNA：质粒自连的环状DNA（普通质粒）、目的基因自连的环状DNA、质粒与目的基因相连的环状DNA（重组质粒）.由此可见，经DNA连接酶处理后，并不能保证每一个质粒都能与目的基因实现重组，因此导入受体细胞的不一定是基因工程所需要的重组质粒，也可能是普通质粒，这就需要对受体细胞进行筛选.

通常在构建基因表达载体时就要考虑到筛选的需要，质粒上需要具有特定的标记基因以利于筛选.例2中的pBR322质粒含有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因（图2-a），因此含有普通pBR322质粒的细胞具有对四环素和氨苄青霉素的双重抗性.如果目的基因插入到四环素抗性基因中，四环素抗性基因就会被破图3坏，对四环素的抗性就会丧失，所以带有重组质粒的受体细胞仅对氨苄青霉素具有抗性，对四环素没有抗性.根据这个特点可筛选出导入重组质粒的受体细胞.筛选时首先要用一小块灭菌的绒布固定在直径较平板略小的圆柱形木块上，制作一个“印章”（即接种工具，如图3），然后采用例2第（2）小题所述的方法进行，最后从图2-c空圈相对应的图2-b中的菌落处分离得到所需的含有重组质粒的细胞.

二、细胞工程中的筛选

1.植物体细胞杂交技术中筛选杂种细胞

例3现有甲、乙两个烟草品种（2N=48），其基因型 分别为rrHH和RRhh，这两对基因位于非同源染色体上，且在光照强度大于800勒克斯时，都不能生长，这是由于它们中的一对隐性纯合基因（rr或hh）作用的结果.取两品种的花药离体培养成植株，然后将它们的叶肉细胞制成原生质体，并将两者相混，使之融合（只考虑2个原生质体的相互融合），诱导产生细胞团.（1）实验开始时必须用 除去不利于原生质体融合的物质.（2）实验中除获得杂种细胞外，还有基因型为 的融合细胞.（3）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出杂种细胞，方法： .在此条件下，有种细胞团不能分化；能分化的细胞团是由的原生质体融合来的.由该细胞团分化发育成的植株，其染色体数是，基因型是.

解析制备原生质体利用酶解法，即用果胶酶和纤维素酶水解细胞壁；花药离体培养形成单倍体植株，利用其叶肉细胞制成的原生质体基因型分别是rH和Rh，如果只考虑两两融合的情况，除获得杂种细胞外，还有原生质体自身融合而成的，基因型分别是rrHH、RRhh；由于隐性纯合基因rr或hh的作用，在光照强度大于800勒克斯时不能生长，因此可将融合后的细胞置于大于800勒克斯光照下培养，自身融合的rrHH、RRhh不能生长，只有基因型为RrHh的杂种细胞能够生长.

答案：（1）纤维素酶和果胶酶 （2）rrHH、RRhh （3）置于大于800勒克斯光照下培养，收集能生长的细胞团 2 甲乙两品种 48 RrHh

知识链接杂种细胞的筛选没有通用的方法，一般根据需要筛选的细胞特点进行.筛选可以用机械方法，也可以用生理学或遗传学的方法.

2.单克隆抗体制备过程中的筛选

例4已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基蝶呤阻断.人淋巴细胞中虽有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖.鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞：

（1）试管中除融合的杂种细胞外，还有 种融合细胞（只考虑两个细胞的融合）.

（2）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出杂种细胞，并说明原理.

方法： .原理： .

（3）欲制备治疗H7N9禽流感的单克隆抗体，已知人B淋巴细胞（染色体组成为2N=46），鼠骨髓瘤细胞（染色体组成为2N=40）.那么B淋巴细胞应取自于 （正常个体、患者），杂交瘤细胞中共有 个染色体组.

解析（1）将人的淋巴细胞和鼠的骨髓瘤细胞混合后加入聚乙二醇促融，如果只考虑两个细胞的融合，则试管中除杂种细胞外，还有2种自身融合细胞；（2）由题意可知，D途径可被氨基蝶呤阻断，故在培养基中加入氨基蝶呤后，只有D途径的骨髓瘤细胞不能进行DNA复制而不能分裂增殖，B淋巴细胞虽然有S途径，但是B细胞一般不分裂增殖，只有杂交瘤细胞中可利用B细胞的S途径进行DNA合成而不断增殖.（3）患者体内可分化出能够分泌抗H7N9禽流感病毒抗体的浆细胞，故所需B淋巴细胞应取自患者，人和鼠都是二倍体，因此杂交瘤细胞中含有4个染色体组.

答案：（1）2 （2）培养液中加入氨基蝶呤，收集增殖的细胞；加入氨基蝶呤后，使D合成途径阻断，仅有D合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞中可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖.（3）患者 4（4）液体 动物血清

知识链接在单克隆抗体的制备中，首先把从脾脏中分离出的B细胞（浆细胞）和骨髓瘤细胞进行融合以获得杂交瘤细胞.

通常采用两步操作进行：第一步采用HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞.HAT选择培养基是在普通培养液中加入次黄嘌呤（H）、 氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）等物质配制而成的，已知细胞中DNA的合成存在D和S两条途径，其中氨基蝶呤可阻断D途径，骨髓瘤细胞仅有D合成途径，B淋巴细胞虽然含有D、S两条途径，但是一般不增殖，这就决定了在HAT培养基中只有B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂交瘤细胞可以利用B淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖，其他细胞不能增殖.由此筛选出的杂交瘤细胞可能是多种B细胞和骨髓瘤细胞融合而成的，因此需要进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞.二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后利用特定抗原检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），如果上清液可与特定抗原发生特异性反应（阳性反应），说明这个培养孔中的细胞就有我们需要的杂交瘤细胞.对培养孔中的细胞继续进行有限稀释，一般重复3～4次，保证每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞，由此获得 “单克隆抗体”——由一个细胞克隆而来的细胞群分泌的抗体.第二次筛选同时也是鉴定的过程.

（收稿日期：2014-02-03）