叶向丽　廖海伟　李煌

【摘要】目的：研究鼠曲草醇提物对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠氣道炎症的影响。方法：采用气管内滴注脂多糖（LPS）加烟熏法建立COPD大鼠模型，造模后第15 日开始药物干预，实验结束采用细胞计数法，计算肺泡灌洗液（BALF）细胞中巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞的比例；采用ELISA法测定BALF中IL-8和TNF-α浓度；同时采用RT-PCR法检测各组大鼠肺组织中IL-8、TNF-α的表达水平。结果：与模型组相比，鼠曲草醇提物组明显减少大鼠BALF中白细胞、巨噬细胞和中性粒细胞百分比（P<0.05），而淋巴细胞百分比无显著性差异。与模型组相比，鼠曲草醇提物组明显降低大鼠BALF中IL-8、TNF-α浓度（P<0.05），同时鼠曲草醇提物组能够显著下调肺组织中IL-8、TNF-α mRNA的表达水平（P<0.05）。结论：鼠曲草醇提组可降低COPD大鼠BALF中白细胞、巨噬细胞和中性粒细胞百分比，降低COPD大鼠BALF中细胞因子IL-8和TNF-α的浓度及mRNA表达水平。

【关键词】 鼠曲草醇提物；慢性阻塞性肺疾病；IL-8；TNF-α

【中图分类号】R-332 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）19-0005-03

Abstract：Objective To study the effect of ethanol extract of Gnaphalium affine on inflammation of chronic obstructive pulmonary disease （COPD） model rats. Methods The COPD model was established by smoking and infusing lipopolysaccharide （LPS）. After 15 days， the rats were given the drugs by orally taking once a day. Ratio of macrophage， neutrophile granulocyte and lymphocytes in BALF cells were evaluated by cytometry. The level of IL-8， TNF-α in BALF were measured by ELISA. Futhermore， the level of IL-8， TNF-α in lung tissue were analysed by RT-PCR. Results Compared with the model group， ethanol extract of Gnaphalium affine obviously reduced the ratio of leukocyte， macrophage and neutrophile granulocyte in BALF cells （P<0.05）， but the ratio of lymphocytes had no significant difference. Compared with the model group， ethanol extract of Gnaphalium affine obviously decreased the level of IL-8， TNF-α in BALF， as well as the level of IL-8， TNF-α in lung tissue （P<0.05）. Conclusion Ethanol extract of Gnaphalium affine has protective effect on lung tissue of COPD rats， and can adjust the level of IL-8， TNF-α， which may be one of its mechanisms of intervening occurrence and development of COPD.

Keywords：COPD；Gnaphalium affine；IL-8；TNF-α

慢性阻塞性肺疾病 （chronic obstructive pulmonary disease，COPD） 是一种以不完全可逆的气流受限为特征的疾病，气流受限呈进行性发展。COPD是呼吸系统常见病，多发病， 常与慢性支气管炎和肺气肿密切相关。流行病学调查发现，其死亡率居全球所有死亡原因的第4位[1]。COPD已成为当今严重的全球性公共卫生问题并成为国内外呼吸界关注的热点。现代研究认为慢性、持续性气道炎症是COPD发生和发展的主要病理机制之一，它与肺部对香烟烟雾等有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。细胞因子IL-8、TNF-α作为主要的炎症递质参与了COPD气管炎症的全过程。

鼠曲草为菊科植物鼠曲草Gnaphalium affine D.Don 的全草，别名佛耳草、追骨风、绒毛草、清明菜等。始载于《名医别录》。《本草纲目》谓其主“寒热， 除肺中寒，大升肺气”，具有化痰止咳、祛风平喘之效。已收载于《中华人民共和国药典》1977年版一部中。其治疗呼吸道疾病疗效已被报道[2-3]。本研究旨在探讨鼠曲草的醇提物对COPD模型大鼠气道炎症的影响。

1 材料

1.1 药物 鼠曲草购自于亳州市清逸中药材科技有限公司，经鉴定为菊科植物鼠曲草Gnaphalium affine D.Don 的全草。取其全草，粉碎成粗粉，加入药材10倍量50%乙醇，加热回流提取2次，每次1 h，合并提取液，减压浓缩至无醇味，加水稀释成0.1 g/ml的药液，备用。

1.2 仪器与试剂 恒温水浴锅（HH-6型，国华电器有限公司）；低温冷却循环泵（DLSB-5/40型，郑州长城科工贸有限公司）；旋转蒸发器（RE-52型，上海亚荣生化仪器厂）；全自动动物血液分析仪（POCH-100IV diff，希森美康医用电子（上海）有限公司）；全自动多功能酶标仪（TECAN，Infinite M200 Pro）。脂多糖（LPS，批号L-2880，Sigma 公司）；无水乙醇（AR；国药集团化学试剂有限公司）；大鼠IL-8、TNF-α酶联免疫分析试剂盒（美国RapidBio（进口分装）；其他试剂均为分析纯。

1.3 动物 SPF级Wistar大鼠60只，8周龄，体重180～220g，雄性，购买自福建中医药大学实验动物中心，动物合格证号200700518642。

2 方法

2.1 大鼠COPD模型的制备 采用市售七匹狼牌过滤嘴香烟，按文献[3]复制COPD模型。将60只大鼠随机分为正常组（10只）、模型组（25只）、鼠曲草醇提物组（25只）。除正常组外，将模型组、鼠曲草醇提物组大鼠分别置于60cm×45cm×55cm 有机玻璃吸烟箱，每个有机玻璃箱内放置10只大鼠，每天上午、下午被动吸烟各1次，每次放置5只香烟，燃尽后更换，持续30分钟，每周吸烟6 d，连续1个月，第30天吸完烟后将大鼠处死。同时除正常组外，分别于第1 d和第14 d向将模型组、鼠曲草醇提物组大鼠气管内注入LPS（0.1 mg/100g）。

2.2 给药 从造模第15 日起，实验动物进行灌胃干预治疗，正常组、模型组给予等体积生理盐水，鼠曲草醇提物组给予0.1g/100g（原药材/大鼠体重），每日灌胃1次，连续治疗一个月。

2.3 标本的采集与处置

2.3.1 标本的采集 造模及给药结束后，采用10%水合氯醛，以300mg/Kg用量腹腔注射麻醉实验大鼠。麻醉后，开胸暴露心肺，分離气管，找出左右肺门（靠近心脏处）并钝性分离，用线结扎左肺门，直剪在支气管开一小口，插入灌胃针并用线结扎固定左肺后，用生理盐水于右肺行支气管肺泡灌洗2ml×3次。肺泡灌洗后提起支气管，取出心脏及肺，切取新鲜肺部组织。

2.3.2 标本处置 BALF标本：收集灌洗液分3管备用，1 ml制成细胞涂片行细胞分类计数；余下采用ELISA法测定BALF中IL-8、TNF-α浓度。 肺组织标本：左上肺放入试管内先存放在液氮罐中，后放入-80℃冰箱中冻存待检RT-PCR。

2.4 BALF细胞计数的测定 试验中肺泡灌洗液细胞计数采用细胞计数板进行计数。油镜下计数100个有核细胞，分别计算巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞的比例。

2.5 ELISA法测定BALF中IL-8和TNF-α浓度 参考试剂盒操作流程，进行ELISA法BALF中IL-8、TNF-α浓度的测定，以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，采用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

2.6 RT-PCR法检测肺组织中IL-8、TNF-α mRNA的表达 采用Trizol 法提取总RNA，逆转录为cDNA后采用DreamTaqTM Green PCR Master Mix （2X）试剂盒进行扩增反应，扩增条件为： 95 ℃ 预变性4 min，94℃变性30 s， 56 ℃等退火40 s， 72 ℃延伸40 s， 35次循环， 72 ℃延伸10 min。PCR 产物用1.5% 琼脂糖凝胶电泳后进行光密度扫描，以甘油醛-3磷酸脱氢酶（GAPDH）基因为内参，各基因的扩增条带的光密度值与各自内参的光密度值之比作为衡量参数，用凝胶成像分析系统Quantity one 进行观察分析。具体的退火温度及引物序列见表1。

2.7 统计学处理 数据以（x±s）表示，采用SPSS 20.0 软件进行分析处理，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）方法分析，以P<0.05作为差异有统计学意义，P<0.01为差异具有高度统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠的行为学变化 在造模过程中，模型组大鼠精神状态不佳、活动迟缓、少动，皮毛暗淡无光泽，可见毛发脱落，进食量减少，体重增加迟缓，同时出现咳嗽、气喘、气急和鼻部分泌物流出等呼吸系统症状，重者可闻及哮鸣音。经鼠曲草醇提物治疗后，大鼠精神状态明显好转，未见明显毛发脱落，进食增加，偶见咳嗽、少见喘鸣和鼻腔分泌物流出。

3.2 鼠曲草醇提物对大鼠BALF炎症细胞的影响 与正常组比较，模型组大鼠BALF中白细胞计数、巨噬细胞和中性粒细胞百分比显著升高（P<0.05），经鼠曲草醇提物干预后，与模型组比较，鼠曲草醇提物组大鼠BALF中白细胞计数、中性粒细胞百分比显著降低（P<0.05），而巨噬细胞无显著性差异。同时正常组、模型组和鼠曲草醇提物组三组的中性粒细胞百分比无统计学差异。

3.3 鼠曲草醇提物对大鼠BALF中细胞因子IL-8和TNF-α含量的影响 与正常组比较，模型组BALF中TNF-α、IL-8含量均升高（P<0.05）；与模型组比较，鼠曲草醇提物组BALF中TNF-α、IL-8的含量明显降低（P<0.05）。结果见表3。

3.4 鼠曲草醇提物对大鼠肺组织中IL-8、TNF-α mRNA表达的影响 结果见图1，与正常组比较，模型组明显上调肺组织中IL-8、TNF-α mRNA 的表达，经鼠曲草醇提物干预后，与模型组比较，鼠曲草醇提物组明显下调IL-8、TNF-α mRNA的表达。

4 讨论

4.1 COPD的发生和发展中，气道炎症为其基本病理改变。在其早期，COPD肺泡灌洗液中呈现出白细胞和中性粒细胞增加，以及巨噬细胞增多和活化。本实验中模型组大鼠BALF中白细胞计数、巨噬细胞和中性粒细胞百分比显著升高（P<0.05），经鼠曲草醇提物干预后，鼠曲草醇提物组大鼠BALF中白细胞计数、中性粒细胞百分比显著降低，提示鼠曲草有改善COPD气道炎症的作用。同时炎症细胞的增多可分泌、释放多种炎症介质和细胞因子，介导和加重气道炎症，IL-8、TNF-α作为COPD发病过程中的主要细胞因子[4-5]，在COPD发病中有重要的作用。本实验中模型组BALF中TNF-α、IL-8含量均升高（P<0.05），经鼠曲草醇提物干预后，鼠曲草醇提物组BALF中TNF-α、IL-8的含量明显降低，同时鼠曲草醇提物组大鼠肺组织中IL-8、TNF-α mRNA表达显著降低，说明鼠曲草可降低炎症细胞因子的水平，也提示鼠曲草有改善COPD气道炎症的作用。

4.2 我国鼠曲草资源丰富，近年来国内外研究表明，其在药品和食品方面均具有很大的开发利用价值。鼠曲草用于呼吸道疾病的治疗已有文献报道，但其药效物质基础及具体作用靶点尚不明确，有文献报道其黄酮类可能是其活性成分[6]。本文开展了鼠曲草醇提物改善COPD大鼠气道炎症的实验研究，为综合开发利用鼠曲草资源提供了科学依据。

参考文献

[1] RM， Petrache I， Elias JA，et al. Apoptosis and emphysema. The missing link[J]. Am J Respir Cell Mol Biol. 2003 May：28（5）：551-554.

[2]田东升.鼠曲草治疗呼吸道疾病的疗效观察[J].中医药信息杂志，1997（6）：22.

[3]俞冰，杜瑾，张亚珍.鼠曲草止咳祛痰作用的实验研究[J].浙江中医药大学学报，2006，30（4）：352-353.

[4] 余桂东. 糖皮质激素对慢性阻塞性肺疾病患者TNF-α及IL-8的作用[J]. 实用医学杂志， 2014， 30（2）： 330-331.

[5] 王文秀， 马超，杜文才.TNF-α在慢性阻塞性肺疾病中的表达及意义[J].大连医科大学学报， 2013， （2）： 143-145.

[6] 徐玉婷，吴丹慧.鼠曲草的研究进展[J].医药导报，2012，31（2）：192-194.

（收稿日期：2015.08.04）