张国亮 李琦军* 白玉娟 李炎 齐晓燕 王彦志 周红艳

【摘要】目的：探讨神经肽Y（NPY）对小神经胶质细胞生成IL-1β的影响。方法：培养的小鼠皮层小胶质细胞N9细胞，将细胞分为Control组、LPS组、NPY+LPS组、NPY组和BIBP3226+NPY+LPS组，每组3个样本，培养各组细胞6h。经免疫细胞化学荧光染色后，显微镜下观察N9细胞的形态学变化。Elisa方法检测培养液中IL-1β蛋白含量，RT-PCR方法检测小胶质细胞中IL-1βmRNA表达水平。结果：孵育各组N9细胞6h后，LPS组培养液中IL-1β蛋白的含量及N9细胞中IL-1βmRNA表达水平显著高于Control组（P<0.05）；LPS+NPY组IL-1β蛋白含量和mRNA表达水平与LPS组相比显著降低（P<0.05）；IBP3226+NPY+LPS组IL-1β蛋白含量和mRNA表达水平与LPS+NPY组相比显著增高（P<0.05）；LPS组和IBP3226+NPY+LPS组之间无显著性差异。NPY组与对照组无显著性差异。结论：NPY通过作用于NPY Y1受体降低小神经胶质细胞N9的生物活性，抑制其生成IL-1β。

【关键词】：神经肽-Y小神经胶质细胞 白介素-1β

【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2015）06-0010-03

小胶质细胞（microglia， MG）属于巨噬细胞，是大脑中产生炎症因子的主要细胞之一，当受到刺激后，MG可释放白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF-a）等细胞因子以及其他生物活性物质[1]，有些活性物质的过分释放会导致神经元损伤。神经肽 Y（NPY）是一种广泛分布于中枢神经系统及周围神经系统的多肽，过去的研究表明NPY对小胶质细胞分泌炎症因子有很大的影响。

本实验我们采用LPS激活小鼠N9细胞，检测其分泌的白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的影响，与提前用NPY处理后的N9作对比，观察NPY是否能够降低N9的IL-1β的分泌水平。

1材料和方法

1 1N9细胞培养及形态学观察

复苏N9细胞（由第四军医大学神经解剖学教研室提供），用含10%血清的DMEM（Dulbeccos modified Eagles medium）培养基（Gibco，Grand Island，NY，USA）培养，供实验用。

1.2细胞形态学观察及纯度鉴定

N9细胞接种于内置盖玻片的六孔培养板， 3天后取出盖玻片，经PBS冲洗；4%多聚甲醛固定30分钟，0.3%TritonX100破膜10分钟，3%山羊血清（Gibco，GrandIsland，NY，USA）封闭30分钟，IBA-1抗体（1：200），4度过夜；荧光二抗（1：100；Proteintech，Chicago，USA），37度孵育1h，封片后荧光显微镜观察N9细胞形态。

1.3 N9细胞分组及处理

以1×105/mL的浓度将N9细胞种于六孔板内，每孔3mL，培养3天后换新鲜无血清培养基培养孵育12小时，将各孔随机分为五组，即CON组，LPS组，NPY+LPS组，NPY组、BIBP3226+NPY+LPS组。CON组为正常对照组，以无血清培养基孵育N9细胞6小时，LPS组是以含终浓度为100ng/ml LPS的无血清培养基孵育N9细胞 6h，NPY+LPS组是先以含NPY （終浓度为1?M） 的无血清培养基孵育N9细胞半小时，然后加入LPS（终浓度为100ng/ml）继续孵育6小时，NPY组是以含NPY（终浓度为1?M）无血清培养基孵育N9细胞6小时，BIBP3226+NPY+LPS组先用含NPYY1受体阻滞剂BIBP3226（终浓度为1?M）的无血清培养基孵育N9细胞半小时，余步骤同NPY+LPS组。6小时后用ELISA法检测培养基中IL-1β含量。六孔板板中的N9细胞留作PCR检测用。

1.4 各组培养液中IL-1β蛋白含量的测定

按说明书操作，使用酶标仪（Theromo Labsystems，Helsinki，Finland，）检测450nm波长处各孔的吸光度（OD值）。根据样品的OD值计算相应的浓度。

1.5.各组N9中IL-1βmRNA表达水平的测定

采用实时荧光定量PCR法检测上述各组小胶质细胞中的IL-1βmRNA表达水平。上海生工生物公司合成引物（表1）。用ABI 7300 Real-Time PCR System （（Applied Biosystems， Foster City， CA， USA）检测并计算目的基因表达量与内参GAPDH比较的相对值（RQ值），用于统计分析。

1.6 统计学处理

利用SPSS10.0统计分析软件进行统计学处理，经正态性检验和方差齐性检验，数据符合正态性和方差齐性的要求，采用重复测量资料的方差分析，数据以mean±SD表示，P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 N9及原代培养的小胶质细胞形态学观察

N9细胞经IBA-1染色后，可见N9细胞被染成红色。（图.1）。

2.2 不同培养液孵育N9 6小时后，培养液中IL-1β蛋白含量的变化

各组孵育N9 6小时后，LPS组和IBP3226+NPY+LPS组培养液中IL-1β的含量显著高于CON组（P<0.01）；但LPS组和IBP3226+NPY+LPS组之间无显著性差异。LPS+NPY组比LPS组IL-1β的含量明显降低（P<0.01），IBP3226+NPY+LPS组与LPS+NPY组相比，IL-1β的含量显著增高（P<0.01），NPY组与对照组无显著性差异。（表2）

2.3 不同培养液孵育N9 6小时后，N9中IL-1βmRNA水平的变化

各组孵育N9 6小时后，LPS组和BIBP3226+NPY+LPS组中N9的IL-1βmRNA水平显著高于CON组（P<0.01）；但LPS组和BIBP3226+NPY+LPS组之间无显著性差异。LPS+NPY组比LPS组MG的IL-1βmRNA水平明顯降低（P<0.01），IBP3226+NPY+LPS组与LPS+NPY组相比，MG的IL-1β的mRNA水平显著增高（P<0.01），NPY组与对照组无显著性差异。

3 讨论

小胶质细胞（MG）广泛分布于中枢神经系统，当中枢神经系统发生病理变化时，小胶质细胞能够迅速做出反应，起到中枢神经系统感受器的作用[1]。例如在癫痫发生后，在该区域的神经元出现明显损伤前小胶质细胞已经发生明显变化[2]，研究证明，小胶质细胞生物活性的变化与癫痫发作的频率和持续的时间有密切关系[3]。 很多资料显示小胶质细胞激活还和中枢神经系统很多疾病有关[4-6]。IL-1β、TNF-a 是最常见的损伤性细胞因子，在中枢神经系统多种生理和病理过程中发挥着重要作用[7]，并与脑损伤的发生、发展有着密切的关系[8-9]。

人体内的神经肽类物质与炎症反应有着较密切的关系 [10-12]， NPY是一种广泛存在于中枢神经系统中的神经肽[13]。本实验采用LPS为N9细胞的激活剂，在LPS处理N9细胞 6小时后， N9细胞培养液中IL-1β明显增高，与对照组有显著差异。加入NPY后能够明显抑制降低N9细胞产生IL-1β蛋白和N9细胞细胞内的IL-1βmRNA表达水平，使用BIBP3226阻断NPY Y1受体后这种抑制作用完全消失，说明NPY是通过Y1受体起到降低MG的免疫活性，减少N9细胞来源的IL-1β产生的。NPY处理小胶质细胞后，培养液中IL-1β蛋白及N9细胞细胞内的IL-1βmRNA水平均未发生明显变化，说明NPY对静止期的小胶质细胞影响不大。本研究表明，NPY对中枢神经系统内的小胶质细胞的免疫活性有调节作用，NPY能下调中枢神经系统内小胶质细胞的免疫活性，抑制IL-1β的产生，这种作用是通过其Y1受体实现的。本研究为NPY以小胶质细胞为靶点治疗包括癫痫在内的与炎症有关的中枢神经系统疾病提供了实验依据。

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*通讯作者 李琦军