方婷等

摘 要 以猪肚菇粗多糖为原料，对其脱蛋白和脱色工艺条件进行优化。采用蛋白酶法和sevag法联合除蛋白，研究不同酶添加量、处理温度、pH值和处理时间等因素对蛋白脱除率的影响，采用正交设计对工艺条件进行了优化。猪肚菇多糖脱色采用大孔吸附树脂，系统研究树脂静态吸附与动态吸附试验。结果表明：最佳脱蛋白工艺为：2 mg/mL猪肚菇粗多糖溶液，木瓜蛋白酶用量1 mg，酶解温度60 ℃，酶解pH值5.5，酶解时间5 h，sevag试剂处理2次，猪肚菇多糖蛋白质脱除率和多糖损失率分别为85.18%和23.41%；最佳脱色工艺为：选用NKA-9树脂脱色，静态吸附时树脂用量1 ∶ 10，时间5 h，温度30 ℃，动态吸附时pH6.0，洗脱速率3 BV/h，猪肚菇多糖脱色率和多糖损失率分别为84.19%和20.79%。

关键词 猪肚菇；多糖；蛋白酶法；脱蛋白；大孔树脂；脱色

中图分类号 S646.9 文献标识码 A

Abstract Using pork bellies mushroom polysaccharides as the raw material， the deproteinized and decoloration process conditions were optimized. Protein enzymatic hydrolysis with sevag method was used to removal protein. The rate of protein removal and polysaccharide loss of pork tripe mushroom polysaccharide were studied under different enzyme dosage， time， temperature， and pH. The optimum process of protein in pork tripe mushroom polysaccharides was obtained through orthogonal experiments. Then， a method for decoloration of pork tripe mushroom polysaccharides was developed through static and dynamic adsorption tests. Its optimum process for the removal of protein：enzyme dosage 1mg， temperature 60 ℃， pH of 5.5 and a time of 5 h， then treated twice with sevag method， protein removal rate was 85.18%， the rate of loss of polysaccharide 23.41%. The optimum bleaching processes， NKA-9 resin optimal conditions for the amount of resin adsorption 1 ∶ 10， time 5 h， and temperature 30 ℃， the dynamic adsorption conditions of pH 6， elution rate 3 BV/h， tripe bleaching mushrooms rate of 84.19%， 20.79% loss rate of polysaccharides.

Key words Pork bellies mushrooms； Polysaccharides； Protease law； Deproteinised； Macroporous resin； Decoloration

猪肚菇（Panus giganteus（Berk.）Corner）是中国近年来新开发的一种功能性食用菌，学名大杯伞，又称“大杯蕈”、“大杯香菇”等[1-4]。猪肚菇子实体是一种食、药兼用菌，营养价值颇高，其中以猪肚菇多糖在其行使生物活性中发挥重要作用，邵颖[5]报道猪肚菇子实体冻干粉中多糖有很高的DPPH自由基清除力，然而，初步提取的猪肚菇多糖中含有一定的蛋白质、色素等杂质，不同程度地影响猪肚菇多糖的活性，严重制约了其在功能性食品等领域的开发应用。

目前，粗多糖脱蛋白主要通过sevag法[6]、三氯乙酸法[7]、酶法[8]、盐酸法[9]、树脂法[10]等，多糖化学法脱色可能导致部分多糖水解，造成一定的损失并对其功能产生较大影响。因此，大多采用蛋白酶法降解杂蛋白。其中，木瓜蛋白酶源于番木瓜[11]，是一种含巯基（-SH）的内切酶，有很强的专一性，被广泛应用于各类精细产品的脱蛋白工艺。另外，在多糖脱色研究中，径向流柱已成为一种有效的分离技术，该方法根据原料组成和结构差异选择不同高分子填充物加强分离效率[12-13]。基于此，本研究以蛋白脱除率及多糖损失率为指标，采用木瓜蛋白酶与sevag法联用对猪肚菇多糖脱蛋白工艺[11]，优化工艺参数；同时采用径向流色谱法，确立猪肚菇多糖脱色工艺，以期为猪肚菇多糖的深加工提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 猪肚菇子实体购自福州农贸市场；木瓜蛋白酶购自北京奥博星生物技术责任有限公司，比活力4 000 U/mg；大孔吸附树脂为6种大孔树脂（AB-8、NKA-9、NKA-Ⅱ、X-5、HPD-600、HP-20型），购自上海摩速科学器材有限公司，物理化学性质见表1；无水乙醇、正丁醇、氯仿、浓硫酸、苯酚、葡萄糖（均为分析纯）。

1.1.2 仪器与设备 UV-2000紫外-可见分光光度计为尤尼柯（上海）仪器有限公司产；RE-52A型旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂产；层析柱Φ3.5×30 cm：上海禾汽玻璃仪器有限公司产；HL-2B型恒流泵上海沪西分析仪器厂有限公司产；L-530型台式低速离心机，长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司产。

1.2 方法

1.2.1 猪肚菇粗多糖制备流程 参考王珊等的方法[7]。

1.2.2 多糖含量和蛋白质含量的检测方法 多糖含量测定采用苯酚-硫酸法；蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法。

1.2.3 酶法联合sevag法脱蛋白试验 （1）单因素实验：配制2 mg/mL猪肚菇粗多糖溶液，经不同温度（40 ℃～70 ℃）、pH值（4.0～7.0）、木瓜蛋白酶的酶添加量（0.5～1.5 mg）和酶解时间（2～7 h）酶解，再经100 ℃沸水中煮15 min灭酶并离心离心10 min（4 000 r/min），后采用sevag法脱蛋白，取上清液测定蛋白质和多糖含量，根据公式计算蛋白脱除率及多糖损失率。

蛋白脱除率/%=

×100

多糖损失率/%=

×100

（2）正交试验：根据单因素试验结果，选取蛋白酶添加量（A）、酶解时间（B）、酶解的温度（C）和pH值（D）4个因素，以蛋白质脱除率为指标，进行正交试验，因数及水平设计如表2。

1.2.4 大孔树脂吸附法脱色试验 （1）树脂种类的筛选：选用AB-8、NKA-9、NKA-Ⅱ、X-5、HPD-600、HPD-20型6种大孔树脂对猪肚菇多糖溶液进行静态吸附试验，根据脱色率筛选出最佳的树脂。

脱色率/%=

×100

（2）树脂静态吸附试验：选用筛选出脱色率最佳的树脂研究其静态吸附工艺的关键参数，包括树脂用量（每10 mL水中含树脂1～6 g）、吸附时间（1～10 h）及吸附温度（20～70 ℃）。将脱蛋白后的猪肚菇多糖加入适量NKA-9型大孔树脂，并置于20 ℃水浴恒温振荡器中振荡24 h（110 r/min），将多糖样品抽滤后取上清液，绘制静态脱色率曲线和多糖损失率曲线，分析树脂脱色效果。

（3）树脂动态吸附试验：在静态吸附工艺参数研究的基础上进行动态吸附工艺研究。采用径向流色谱法，将去离子水加入层析柱中，再将预处理好的20 mL NKA-9型树脂装入Φ 3.5×25 cm同方向层析柱中。分别考察上柱液pH值（2.0～8.0）及吸附流速（2～8 BV/h）对脱色效果的影响，清液取样，绘制静态脱色率曲线和多糖损失率曲线，确定最佳工艺参数。

2 结果与分析

2.1 酶法联合sevag法脱蛋白试验

2.1.1 单因素试验 （1）不同酶解温度对猪肚菇多糖蛋白脱除率的影响：由图1可知，当酶解pH值为5.0，酶解时间为4 h，酶添加量为1 mg时，随着酶解温度的升高，蛋白质脱除率呈现先上升后下降的趋势。当酶解温度达到60 ℃时，蛋白脱除率达到最大。这是由于随着温度的升高，酶活力增强，酶液的扩散作用相对提高；但当温度继续上升时，蛋白酶结构发生转变，酶活力受到抑制，蛋白脱除率随之下降。同时，不同温度处理下，多糖损失率一直维持在30%以下。因此，选择60 ℃为酶解的最适温度。

（2）不同酶解pH值对猪肚菇多糖蛋白脱除率的影响：酶在水解体系中的活性与底物解离状态在一定程度受pH的作用。由图2可知出，当酶解温度为60 ℃，酶解时间为4 h，酶添加量为1 mg时，酶解pH小于5.0时，蛋白脱除率随着pH的增加而迅速上升；酶解pH大于5.0时，蛋白脱除率随着pH的增大而显著降低（p﹤0.05）。同时，随着pH的升高，多糖损失率也在不断提高，因此，选择5.0为酶解的最适pH值。

（3）不同酶解时间对猪肚菇多糖蛋白脱除率的影响：由图3可知，当酶解温度为60 ℃，酶解pH值为5.0，酶添加量为1 mg时，当酶促反应时间达到一定时，底物量浓度降低，使得酶促反应速率降低，蛋白脱除率开始下降。不同酶解时间对多糖损失率影响并不显著。因此，选择4 h为最佳酶解时间。

（4）不同酶添加量对猪肚菇多糖蛋白脱除率的影响：由图4可知，当酶解温度为60 ℃，酶解pH为5.0，酶解时间为4 h时，随着酶浓度的上升，酶与底物接触的机会增加，脱蛋白效果明显增强，在添加量为1 mg时最大；之后蛋白脱除率尚无较大变化。同时，随着酶用量的增加，多糖损失率也缓慢上升。考虑木瓜蛋白酶在水解蛋白质的同时，也具有从蛋白质的水解物再合成蛋白类物质的能力，因此，选择1 mg为酶解的最适酶添加量。

2.1.2 正交试验 由试验结果可以看出，酶用量、温度、时间、pH值均不同程度地影响蛋白脱除率，选择酶量、温度、时间、pH值 4种因素，以蛋白脱除率为指标，确定正交试验，结果如表3所示。

由表4可看出，影响蛋白质脱除率的主次因素是A>C>B>D，即酶添加量（A）>时间（C）>温度（B）>pH值（D）。对正交实验结果进行方差分析（表5），可以看出酶添加量对蛋白脱除率影响极显著（p<0.01），处理时间和温度对蛋白脱除率效果影响显著。酶法脱除猪肚菇粗多糖蛋白质的最优工艺参数为A2B2C2D2，即酶添加量1 mg，温度60 ℃，处理时间5 h，pH值为5.5。在此条件下，蛋白质脱除率为72.71%，多糖损失率为18.78%。

原料经酶处理后，大部分游离蛋白质及部分与多糖结合的蛋白质被水解，粗多糖中蛋白质含量大大降低，将酶处理过后的猪肚菇多糖利用sevag试剂进行2次脱蛋白处理，蛋白脱除率为85.18%，多糖损失率为23.41%。当sevag试剂处理次数超过2次，原料蛋白脱除率无明显增加，但多糖损失率将显著增加。试验结果显示，酶处理过后的猪肚菇多糖经5次sevag试剂处理，多糖损失率将达32.34%。

2.2 大孔树脂吸附法脱色试验

2.2.1 树脂种类的筛选 选用6种大孔树脂对猪肚菇多糖溶液进行静态吸附试验，结果见表5。由表5可知，6种大孔树脂中大孔树脂NKA-9脱色率为75.9%，多糖损失率为22.1%，吸附能力强，且多糖损失率较低，所以选择大孔吸附树脂NKA-9做进一步吸附试验。

2.2.2 NKA-9型树脂对猪肚菇多糖溶液色素的静态吸附研究 （1）树脂用量对脱色率和多糖损失率的影响：由图5可知，当脱色时间为24 h，吸附温度为20 ℃时，随着树脂NKA-9用量的增加，脱色率显著下降，且当用量达到3 g后，脱色率较为稳定，并未进一步提高。这可能是由于某些色素与大孔吸附树脂结合性较弱，无法被吸附。同时，树脂用量的增加导致少量多糖被吸附，多糖损失率缓慢上升。因此，树脂用量选择每10 mL水中含树脂1 g。

（2）吸附时间对脱色率和多糖损失率的影响：由图6可知，当树脂用量为1 g/10 mL，吸附温度为20 ℃时，随着脱色时间的延长，脱色率显著增大，脱色时间达5 h之后，脱色率基本保持不变，色素的吸附与解析达到动态平衡。同时，多糖损失率随着脱色时间的增加并未出现显著改变。因此，脱色时间选择5 h。

（3）吸附温度对脱色率和多糖损失率的影响：由图7可知，当树脂用量为1 g/10 mL，脱色时间为5 h时；随着温度的升高，色素分子扩散加速，多糖溶液的粘度下降，有利于色素与多糖分子分离，在温度为30 ℃时达到最佳效果，然后变化缓慢。这是由于吸附为一放热过程，温度提高到一定程度，解吸速度高于吸附速度，脱色率降低，同时多糖的损失率也会增大。因此，脱色温度应控制在30 ℃左右较为合适。

2.2.3 NKA-9型树脂对猪肚菇多糖溶液色素的动态吸附研究 （1）上柱液pH值对脱色率的影响：由图8可知，当上柱温度30 ℃，流速2 BV/h时；NKA-9树脂的脱色率是随着pH值的增大呈缓慢的先上升后下降的趋势，在pH值为6达到最大值，这可能是由于猪肚菇多糖中的色素在偏酸性条件下呈弱极性或非极性。当溶液偏碱性时，某些色素分子构象可能发生改变，从而使脱色率降低。

（2）不同流速对脱色率的影响：由图9可知，当上柱温度30 ℃，pH值为6.0时流速3 BV/h色素吸附效果最佳。这可能是由于流速越慢越有利于猪肚菇多糖液中色素分子充分扩散，充分被树脂吸附。流速过快，无法充分接触吸附造成脱色率快速下降。在没有进行脱蛋白脱色前的猪肚菇多糖中蛋白质含量约为15.2%，色素含量约为13.58%，除蛋白之后的蛋白质含量为0.065 6%，脱色后的色素含量为0.021 5%，蛋白质含量明显下降，脱色效果明显。

3 讨论与结论

陈俊真[14]研究了香菇多糖脱蛋白工艺，表明采用酶法和sevag法联用的蛋白脱除率达88.1%。张怡等[15]人采用蛋白酶法结合Sevag法对金柑粗多糖进行脱蛋白，优化了酶添加量、温度、pH值、时间等工艺参数，金桔粗多糖蛋白脱除率可达85.18%。肖丽霞等[16]在香菇多糖的树脂脱色工艺里具体提出树脂对食用菌多糖的有效脱色。罗玺等[17]人采用D303树脂对灵芝多糖脱色工艺进行响应面优化，结果表明脱色率高达91.89%。综上所述，本文采用的酶解法结合sevag法及大孔树脂吸附法具有一定的可行性，并且在纯化效率和多糖得率方面相比其他方法有明显优势。

本研究以蛋白脱除率、脱色率及多糖损失率为评价指标，采用蛋白酶法综合Sevag法对猪肚菇多糖溶液进行脱蛋白处理，及大孔树脂吸附法对脱蛋白后的猪肚菇多糖进行脱色处理，通过正交试验优化，确定最佳脱蛋白工艺为：酶添加量1 mg，温度60 ℃，作用时间5 h，pH值5.5，sevag试剂处理2次。在此工艺下，蛋白质脱除率和多糖损失率分别为85.18%和23.41%。脱色最佳工艺为：NKA-9树脂用量1 ∶ 10，脱色时间5 h，脱色温度30 ℃，pH值6.0，流速3 BV/h。在此工艺下，脱色率为84.19%，多糖损失率为20.79%。

参考文献

[1] 陈 睿， 孙润广， 王小梅， 等. 猪肚菇多糖WPG1的相对分子质量测定及原子力显微镜观测[J]. 生物加工过程， 2013， 11（5）： 61-66.

[2] 虞 立， 夏道宗， 李颖瑞， 等. 猪肚菇多糖提取工艺的响应面法优化[J]. 食品科技， 2013， 38（8）： 232-235.

[3] 戴玉成， 周丽伟， 杨祝良， 等. 中国食用菌名录[J]. 菌物学报， 2010， 29（1）： 1-21.

[4] 杨润亚， 杨树德， 董洪新， 等. 响应面法优化猪肚菇多糖的提取工艺[J]. 食品科学， 2011， 32（14）： 29-33.

[5] 邵 颖. 食用菌多糖含量和清除自由基活性的研究[J]. 徐州工程学院学报， 2007， 22（10）： 36-39.

[6] 王文平， 郭祀远， 李 琳， 等. 野木瓜水溶性多糖的提取、 分离及结构分析[J]. 华南理工大学学报， 2008， 36（7）： 128-133.

[7] 王 珊， 黄胜阳. 植物多糖提取液脱蛋白方法的研究进展[J]. 食品科技， 2012， 37（9）： 188-191.

[8] 陈彦平， 刘振春. 木瓜蛋白酶水解玉米胚芽蛋白的研究[J]. 吉林农业大学学报， 2008， 30（5）： 750-752.

[9] 解耸林， 王志兵， 刘洪霞. 粪鬼伞多糖脱蛋白方法的研究[J]. 食品与机械， 2010， 26（2）： 5-7.

[10] Liu J， Luo J， Sun Y， et al. A simple method for the simultaneous decoloration and deproteinization of crude levan extract from Paenibacillus polymyxa EJS-3 by macroporous[J]. Bioresource Technology， 2010， （101）： 6 077-6 083.

[11] 帅学宏， 杨 燕， 黄庆洲， 等. 木瓜蛋白酶法提取青蒿多糖的工艺研究[J]. 江苏农业科学， 2012， 40（4）： 125-128.

[12] Wei H， Ruan J L， Lei Y F. Enrichment and purification of flavones from rhizomes of Abacopteris penangiana by macroporous resins[J]. Chinese Journal of Natural Medicines， 2012， 10（2）： 119-124.

[13] Yang R， Meng D， Song Y， et al. Simultaneous decoloration and deproteinization of crude polysaccharide from pumpkin residues by vross-linked polystyrene macroporous resin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2012， （60）： 8 450-8 456.

[14] 陈俊真. 酶法脱除香菇粗多糖蛋白质的工艺研究[J]. 食品工业， 2011（1）： 34-36.

[15] 张 怡， 曾红亮， 曾绍校， 等. 金柑多糖酶法脱蛋白工艺的研究[J]. 热带作物学报， 2012， 33（1）： 166-170.

[16] 肖丽霞， 于洪涛， 胡晓松. 香菇多糖的树脂脱色工艺研究[J].食品与机械， 2011， 27（6）： 241-244.

[17] 罗 玺， 唐庆九， 张劲松， 等. 灵芝多糖树脂法脱色工艺优化[J]. 食品科学， 2011， 32（16）： 5-10.