王雪君等

摘 要 为了解水稻不同生长时期内生细菌的动态变化及其多样性，以水稻品种明恢63（MH63）为研究对象，种植于海南省三亚市连作水稻试验田中，分别于水稻幼苗期、分蘖期、开花期和结实期（2014年1月到4月份）分离茎部可培养内生细菌。结果表明：共获得了细菌域4个门6个纲51个属99个种共计529株分离菌株，其中幼苗期分离到23个属33个种，分蘖期分离到30个属44个种，开花期分离到15个属20个种，结实期分离到20个属29个种。上述4个生长时期均分离到伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）、草螺菌属（Herbaspirillum）和黄杆菌属（Flavobacterium），且以伯克霍尔德氏菌属为优势菌属。多样性指数排序：分蘖期>幼苗期>结实期>开花期；优势度指数排序：开花期>结实期>幼苗期>分蘖期。水稻茎部内生细菌具有较丰富的遗传多样性，不同生长期的种群数量、优势度存在差异，开花期优势菌群集中，优势属突出，优势度较高；而分蘖期优势度较低，但种群种类较丰富，且分布均匀。

关键词 水稻；内生细菌；不同时期；多样性

中图分类号 S511；Q939.11 文献标识码 A

Abstract To understand the biodiversity and distribution of endobacteria in rice though the whole grow stages， we isolated and identified the endobacteria from rice cultivar Minghui 63（MH63）crossing the whole growth stages including seedling stage， tillering stage， flowering stage and productive stage. The rice endobacteria（529 isolates in total）belong to 4 phylums， 6 classes， 51 genus， and 99 species. Among them， 33 species （23 genus） were isolated from rice seedling stage； 44 species （30 genus） were isolated from rice tillering stage；20 species（15 genus）were isolated from rice flowering stage； and 29 species （20 genus） were isolated from rice productive stage. The dominated class is Burkholderia， leading Herbaspirillum and Flavobacterium which consistently present in all growth stages. Shannon-Wiener index（H′）revealed that H′tillering>H′seedling>H′productive>H′flowering. Simpson index（D） revealed that Dflowering>Dproductive>Dseedling>Dtillering. Our study inferred that the rice endobacteria were diversity， the Shannon-Wiener index and Simpson index was difference between the growth stages. Additionally， we found that the most diversified endobacteria presented in tillering stage， which suggested the interaction between endobacteria and plant might more activate. Less diversity was found in flowering stage indicated that flowering stage have more dominant species.

Key words Rice（Oryza sativa）；Endobacteria；Four growth stages；Diversity

植物内生细菌生活在宿主体内的特殊环境中，对植物的生长发育和生态功能产生重要影响[1]，包括为宿主植物提供激素，促进植物生长[2]、植物残骸的生物降解[3]、植物重金属污染的修复[4]及植物芳香族化合物的降解[5]，也可作为生物防治菌抵抗病菌[6]和虫害[7]，或作为生物肥料增加产量[8]，以及提高宿主植物的抗逆性[9]等。内生菌多样性的研究对探索植物-微生物互作机制、反应宿主植物生长情况、提高宿主抗病和抗逆境的能力、开发可作为生物肥料及具有生防载体菌的生物资源等具有重要意义。

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，目前水稻产量的提高主要靠大面积施用化肥和农药，对环境造成极大的污染。而微生物肥料具有无毒、无污染、作用时间长、成本低等特点，可以弥补化学肥料和农药的缺点。近几年植物内生菌逐步作为生物肥料及生防载体菌被加以利用[1]。

目前，国内外研究工作主要集中于不同品种水稻内生菌与品系之间的关系研究[10]，以及内生菌与宿主植物或根际土壤微生物的相互作用[11]，而关于水稻不同生长发育期内生菌群落多样性的研究以及内生菌对不同时期水稻生长发育的作用和影响报道甚少。黎起秦等[12]对广西水稻苗期、分蘖期、孕穗期、灌浆期和乳熟期的内生细菌进行了分离鉴定，但分离到的菌种数量较少。本研究通过分离水稻4个主要生长时期的茎组织内生细菌来揭示内生菌群落结构的多态性，以期掌握水稻内生菌资源情况及了解内生菌群落结构与水稻生长时期的关系，为深入探讨内生菌与水稻间的相互作用机制和发掘植物益生内生菌奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试水稻品种为明恢63（MH63），种子由中国农业科学院植物保护研究所提供。于2013年12月24日播种，常规水育秧，3叶期移栽。试验田位于海南省三亚市南繁科学技术研究院内，土壤质地为沙性土，中等肥力，前作水稻。水稻生长期间按常规进行水肥和病虫害管理。于2014年1月、2月、3月、4月中下旬分别采集水稻幼苗期、分蘖期、开花期和结实期的水稻植株。

1.2 方法

1.2.1 采样方法 使用对角线五点采样法采集样品，每点采样3株，每小区采15株，将水稻连根带土挖出，并在48 h内将样品处理完毕。

1.2.2 水稻茎组织内生菌分离 采用表面消毒研磨法分离水稻内生菌[13]。（1）称取水稻茎部组织5 g，置于20%的次氯酸钠溶液（加入2滴吐温20）中浸泡10 min，再用无菌水漂洗3次，并将最后一次漂洗过的无菌水涂布平板进行细菌培养，若无细菌生长则证明植物材料表面已消毒完全；（2）将漂洗好的样品移入无菌研钵中，用灭菌的剪刀将材料剪碎，加入20 mL无菌水，充分研磨10 min，再分别取200 μL研磨液和10倍稀释溶液涂平板；（3）将平板置于28 ℃培养箱中培养48 h，挑取单菌落，进行划线纯化培养，再从划线培养的平板上挑取单菌落于液体培养基中进行培养，振荡摇床的培养温度为28 ℃，转速为150 r/min，培养28～36 h，将菌液分装备份，部分菌体用于DNA提取，部分菌体用于低温保存。

1.2.3 内生菌培养基 YMA培养基：甘露醇10 g，K2HPO4 0.25 g，MgSO47H2O 0.2 g，NaCl 0.1g，CaCO3 0.1g，酵母粉3.0 g，琼脂15 g，加水至1 L，pH7.0～7.2；BPA肉汁胨培养基：牛肉膏 3 g，蛋白胨5 g，酵母粉1 g，蔗糖10 g，加水至1 L，pH 7.0～7.2。

1.2.4 菌种的保存 吸取0.5 mL菌液及等体积40%的甘油于离心管中，制成20%的菌种，于-80 ℃保存。

1.2.5 DNA提取 将供试菌株活化后接种到液体培养基中，于28 ℃振荡培养48 h，待菌体生长至对数中后期，离心收集菌体于2 mL离心管中。采用硅藻土-碱性裂解提取法[14]提取内生细菌DNA。

1.2.6 16S rDNA扩增 以提取的内生菌DNA为模板扩增细菌16S rDNA，正向引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′），反向引物1 492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）[15]。50 μL PCR反应体系：DNA模板（10 ng/μL）1μL，引物（10 pmol/μL）各1 μL，2×Go Taq Green Master Mix（Promega）25 μL，ddH2O 22 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，57 ℃复性30 s，72 ℃延伸1.4 min， 共35个循环；72 ℃延伸10 min。将PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.3 数据处理

1.3.1 水稻内生菌的鉴定 将测序得到的结果拼接后，分别登陆NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和Ezbiocloud（http：//www.ezbiocloud.net/）进行序列比对，确定其与已知序列的同源关系，序列相似性达到98%以上的归为同一个种。

1.3.2 内生细菌多样性指数计算[16] Shannon-Wiener多样性指数（H′）、Simpson优势度指数（D）计算公式如下：

H′=-Σ[Ni/Nln（Ni/N）]

式中：Ni为第i个种的个体数目，N为群落中所有种的个体总数。群落中生物种类越多代表群落的复杂程度增高，即H′值愈大，多样性越高，群落所含的信息量愈丰富。

D=1-ΣPi2

其中：Pi=Ni/N。D值越大，表示优势物种越少，亦表示奇异度越高。

2 结果与分析

2.1 水稻可培养内生细菌的分离与鉴定结果

通过平板培养的方法从不同时期水稻茎内共分离到内生细菌529株，以27F、1492R为引物进行16SrDNA片段扩增，得到长度约1 400 bp的扩增片段。将测序所得到的序列拼接后在Ezbiocloud中进行比对，相似度大于98%以上的归为同一个种。结果表明（表1），水稻品种明恢63茎部内生菌涉及细菌域的4个门、6个纲、51个属，共99个种。包括变形菌门（Proteobacteria）α-变形菌纲（Alphapro

teobacteria）的14个属、 β-变形菌纲（Betaproteobacteria）的10个属、 γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）的9个属、 厚壁菌门（Firmicutes）杆菌纲（Bacilli）的7个属、 拟杆菌门（Bacteroidetes）拟杆菌纲（Bacteroidetes）的4个属以及放线菌门（Actinobacteria）放线菌纲（Actinobacteria）的7个属， 主要包括伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）的8个不同种； 其次，芽孢杆菌属（Bacillus）和根瘤菌属（Rhizobium）各含有6个不同种；无色菌属（Achromobacter）和新鞘氨醇杆菌属（Novosphingobium）各含有5个不同种。

2.2 水稻茎部内生细菌在各个时期的生长情况

水稻茎组织内生细菌在不同时期的生长情况统计结果见表2。水稻幼苗期、分蘖期、开花期、结实期分离到的茎组织内生细菌分别为23个属33个种、30个属44个种、15个属20个种、20个属29个种。其中分蘖期水稻茎部内生细菌种类最多，开花期内生细菌种类最少，且不含厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）。分离所得的水稻茎部内生细菌中，Burkholderia gladioli在幼苗期和开花期丰富度均最高，分别占17.35%和20%；Burkholderia vietnamiensis在分蘖期丰富度最高，占11.96%；Burkholderia seminalis在结实期丰富度最高，占16.67%。

在水稻的4个生长时期中，伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）、草螺菌属（Herbaspirillum）和黄杆菌属（Flavobacterium）均有发现。在水稻幼苗期、分蘖期和开花期，伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）为主要优势菌，相对丰度分别为17.34%，13.04%，40.00%；在水稻结实期，优势菌为芽孢杆菌（Bacillus）和伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia），相对丰度分别为20.99%和20.37%。

水稻4个时期均含有特异的内生细菌种类。Kaistia、Devosia、Roseateles、Dyadobacter、Stenotro-

phomonas仅分离于水稻幼苗期；Ensifer、Ancylobacter、Cupriavidus、Ideonella、Pelomonas、Enterobacter、Cohnella、Novosphingobium、Promicromonospora、Met-

hylobacterium、Leucobacter仅分离于水稻分蘖期；Xenophilus、Dyella、Kosakonia仅分离于水稻开花期；Labrys、Shinella、Acidovorax、Paenibacillus、Rummeliibacillus、Pseudoxanthomonas、Xanthomonas、Sphingobacterium仅分离于水稻结实期。

2.3 不同生长时期水稻茎部内生细菌多样性分析

植物内生菌的生物多样性是衡量其内环境是否稳定和健康的一个重要指标，适宜的植物内环境，其内生细菌多样性丰富，优势度低，细菌种类分布均匀。通过计算得到水稻4个时期茎组织内生细菌的多样性指数和优势度指数。结果表明（图1），4个时期水稻茎部内生细菌的Shannon-Wienner多样性指数和 Simpson优势度指数为：幼苗期（3.13，0.053）、分蘖期（3.49，0.035）、开花期（2.62，0.087）、结实期（2.80，0.081）。Shannon-Wienner多样性指数排序：分蘖期>幼苗期>结实期>开花期；Simpson优势度指数排序：开花期>结实期>幼苗期>分蘖期。水稻茎部内生细菌具有较丰富的遗传多样性，不同生长期茎组织内生细菌种群多样性、优势度存在差异。分蘖期水稻茎部内生细菌优势度较低，但种群种类较丰富，且分布均匀；开花期水稻茎部内生细菌优势菌群集中，优势属突出，存在单一物种Burkholderia gladioli（相对丰度高达20%），造成开花期水稻茎组织内生细菌优势度最大。

3 讨论与结论

为了得到能够用于纯培养并能进一步研究、应用的植物内生细菌，本研究采用传统的分离培养方法对水稻4个不同生长期茎组织内生细菌进行分离、纯化及鉴定。目前报道的水稻内生细菌种类33个属64个种，主要包括Bacillus、Enterobacteriaceae、

Methylobacterium、Pantoea、Pseudomonas及其相近属。本研究分离出了种类更加丰富的水稻内生细菌。其中，水稻幼苗期、分蘖期、开花期优势菌为伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia），且种数和丰富度均最高；而结实期优势菌为芽孢杆菌（Bacillus）和伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia），这与刘云霞等[17]和胡桂萍等[10]报道的从水稻中分离到的内生细菌优势菌为芽孢杆菌属的结果相同。

本研究发现，在水稻的4个生长时期，水稻茎部中都存在黄杆菌（Flavobacterium）、草螺菌（Herbaspirillum）和伯克霍尔德氏菌（Burkholderia），它们在水稻与环境的互作过程中可能发挥着重要的作用。王银善等[18]从农药污染严重的棉田土中分离到一株对硫磷降解能力较强的黄杆菌P3-2，该菌还可降解杀螟松、甲基对硫磷和水胺硫磷等有机磷农药。王以斌等[19]发现，黄杆菌能够产生红色抑藻活性物质（灵菌红素），可有效抑制塔玛亚历山大藻细胞的生长。草螺菌作为植物体内的微需氧固氮菌，是一类嗜用有机酸、耐性强、可在高糖培养基上生长并固氮的微生物。伯克霍尔德氏菌是一类能够利用自身固氮的微生物，在水稻4个生育期中最有优势。李纪顺等[20]研究发现，在小麦上分离得到的一株伯克霍尔德氏菌具有固氮和解磷活性，能促进小麦根的生长，且对小麦纹枯病、小麦全蚀病和番茄南方根结线虫病等都具有良好防治效果。

植物不同生长时期的内环境有所不同，会影响植物内生菌群落结构及其多样性的变化。水稻茎组织内生细菌种类丰富度在宿主植物中的变化规律是：从幼苗期到分蘖期上升，开花期下降，结实期丰富度又有所上升。黎起秦等[12]研究发现，广西水稻内生菌数量从苗期到分蘖期上升，于孕穗期达到最高，从灌浆期到乳熟期数量下降。这与本研究结果（开花期水稻茎部内生菌丰富度相对较低，结实期水稻茎部内生细菌又有所增加）不太一致，这可能是由于植物内生菌主要来自土壤、空气、种子，与植物品种、栽培环境、气候条件等有着直接的关系。

本研究得到的内生细菌中有大量的有益微生物，可用于开发生物肥料，或作为生物防治菌和环境污染修复菌。这些益生菌如何有效应用于农业生产中仍有待深入研究。同时，在今后的研究中，还需进一步揭示这些内生细菌对宿主稻株的影响和作用，以及内生菌群落的变化与水稻生长之间的关系等。这些问题的明确对今后水稻栽培和生物防治具有积极的意义。

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