胡海芳，范宇琴，王燕，阳玉萍，张华(乌鲁木齐市头屯河区中心医院耳鼻咽喉科，乌鲁木齐830000;新疆医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科，乌鲁木齐830054)

新疆维吾尔、汉族CD14基因-159C/T多态性与变应性鼻炎关联分析

胡海芳1，范宇琴2，王燕2，阳玉萍2，张华2
(1乌鲁木齐市头屯河区中心医院耳鼻咽喉科，乌鲁木齐830000;2新疆医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科，乌鲁木齐830054)

目的探讨新疆地区维吾尔、汉族CD14基因多态性与变应性鼻炎的关系。方法选取在新疆医科大学第一附属医院耳鼻喉科和变态反应门诊就诊的维吾尔、汉族变应性鼻炎患者300例(病例组)与同期体检中心体检健康者300例(对照组)。应用SNaPshot SNP分型技术对600例样本进行SNP位点分型，检测CD14基因启动子区的-159位点(rs2569190)。采用病例-对照关联分析方法进行基因型和等位基因频率分析。并将新疆地区维吾尔、汉族该位点多态性与北京、重庆、湖北、广东、台湾、德国、日本、美国、澳大利亚等不同种群进行比较。结果新疆地区维吾尔、汉族变应性鼻炎组与对照组CD14/-159位点基因型和等位基因分布频率差异无统计学意义(P＞0.05)。汉族变应性鼻炎组与对照组间基因型和等位基因频率分布差异无统计学意义(P＞0.05)。维吾尔族变应性鼻炎组与对照组间基因型和等位基因频率分布差异无统计学意义(P＞0.05)。新疆地区人群CD14/-159位点多态性与广东、德国、美国、澳大利亚人群相比有统计学意义，而与其他种群相接近。结论新疆地区维吾尔、汉族都存在CD14-159C/T多态性，都以CT基因型和T等位基因为主，未发现CD14/-159多态性和变应性鼻炎发病之间的关联。

维吾尔族;汉族;变应性鼻炎;CD14基因;多态性

变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是特应性个体接触致敏原后由IgE介导的介质(主要是组胺)释放并由多种免疫活性细胞和细胞因子等参与的鼻黏膜慢性炎症反应疾病。变应性鼻炎患病率高，且呈上升趋势，已成为国际关注的全球性疾病。我国针对中心城市人群的初步研究表明，平均自报患病率约为11.1%，不同地区间差异很大［1］，据估计在世界范围内的患病率为10%～25%［2］，是一类复杂的多基因疾病，严重危害人类健康的公共卫生。越来越多的证据表明变应性鼻炎的发病是遗传与环境因素共同作用的结果。根据被广泛接受的多基因疾病的“common disease，common variams”假说，变应性鼻炎与多个基因的常见变异有关，其中CD14基因受到了普遍关注。由于启动子区是调控蛋白表达的关键因素之一，因此位于启动子区的基因多态性具有重要意义，启动子区的碱基变异能影响启动子区内核转录因子结合位点的数量，是调控CD14基因表达的重要单核苷酸多态性位点，其启动子区-159位点C/T多态性与AR的发病存在关联性，但是不同地区的研究结论存在较大的争议。由于不同人群起源及演化的不同，在独特的地理环境下，受群体起源、群体稳定性、生活习惯、风俗、文化、环境暴露因子、亚群体结构的不同，即使是同一位点的SNP在同一疾病易感座位上的基因频率会有很大差别。为此，本研究对新疆地区维吾尔族、汉族部分AR患者和正常人群的CD14基因-159位点SNP分型进行检测，以探讨CD14基因-159C/T多态性与AR发病是否存在关联。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2009年8月-2010年7月就诊于新疆医科大学第一附属医院耳鼻喉科和变态反应门诊的变应性鼻炎患者300例(病例组)，其中维吾尔族150例，汉族150例，男女比例为1∶1.05，年龄3～82岁，平均年龄为(39.8±14.1)岁，全部患者无血缘关系。入选标准:诊断符合2009年武夷山会议变应性鼻炎诊断标准［3］。300例患者均需完成以下问卷及试验:变应性鼻炎病史、药物及食物过敏史、家族过敏史、前鼻镜检查、皮肤阿罗格点刺试验(变应原试液和点刺针均为德国默克集团Allergopharma公司出品的标准化变应原试液)。选新疆地区常见吸入物几种变应原:艾蒿、藜、豚草、车前草、霉菌类、树木类、寄生虫类(尘螨、粉螨)、禾本类。同时以生理盐水作阴性对照，组胺作阳性对照。至少1种为(++)或(++)以上为阳性。另选择在新疆医科大学第一附属医院体检中心进行体检的健康者300例(对照组)，为新疆地区常住居民，均无直接血缘关系，均需完成前鼻镜检查和皮肤阿罗格点刺试验阴性者。其中维吾尔族150例、汉族150例，男女比例为1∶1.05，年龄2～76岁，平均年龄为(33.8± 16.3)岁。排除标准:抽血前2 w内服用皮质类固醇及抗组胺药。两组性别和年龄比较均差异无统计学意义(P＞0.05)。病例组和对照组都签有书面同意书，并经疆医科大学第一附属医院医学研究伦理委员会审查批准。

1.2 方法

1.2.1 标本采集抽取研究对象空腹肘静脉血2 mL，加入含EDTA的抗凝管，放置-70℃保存。

1.2.2 模板DNA提取用TIANGEN试剂盒方法提取DNA。提取步骤严格按照使用说明进行操作。DNA样本取1μL，将样本稀释到工作浓度5～10 ng/μL。PCR反应体系引物用在线Primer3软件设计:上游引物5'-GCGCCTGAGTCATCAGGACACT;下游引物5'-AACTCTTCGGCTGCCTCTGACA3'。PCR反应体系(10μL)包含1×GC buffer I(TAKARA)、3.0 mMMg2+、0.3 mMdNTP、1 U Taq DNA聚合酶(Qiagen公司，Inc.)、1μL样本DNA和1μL PCR上下游引物各1μL。PCR循环程序:95℃2 min;94℃20 s，65～0.5℃40 s，72℃1 min 30 s，共11个循环;94℃20 s，59℃30 s，72℃1.5 min，共24个循环;72℃2 min;4℃保存。

1.2.3 PCR产物纯化在10μLPCR产物中加入1 U虾碱酶(SAP)和1 U外切酶Ⅰ(EXOⅠ，Promega)，37℃温浴1 h，然后75℃灭活15 min。

1.2.4 SNaPshot多重单碱基延伸反应延伸反应体系(10μL)包括5μL SNaPshot Multiplex Kit (ABI)、2μL纯化后多重PCR产物、1μL延伸引物混合物、2μL超纯水。PCR循环程序:96℃1 min; 96℃10 s、50℃5 s、60℃30 s，共28个循环;4℃保存。延伸产物纯化，在10μL延伸产物中加入1 U SAP酶，37℃温浴1 h，然后75℃灭活15min。

1.2.5 测序反应取0.5μL纯化后的延伸产物，与0.5μL Liz120 Size Standard，9μL Hi-Di混匀，95℃变性5 min后上ABI3130XL测序。SNP分型用GeneMapper4.0(Appliedbiosystems)来分析。

1.3 基因型和等位基因频率分析采用病例-对照关联分析方法进行基因型和等位基因频率分析。应用公式:等位基因频率=等位基因阳性数/总基因数(患者数×2)，计算出病例组和对照组CD14基因型频率和等位基因频率，并将新疆地区维吾尔族、汉族CD14基因-159位点多态性与北京、重庆［4］、广东［5］、湖北［6］、台湾［7］、日本［8］、德国［9］、美国［10］、澳大利亚［11］等不同种群进行比较。

1.4 统计学处理采用SPSS17.0统计软件包进行统计学分析。两组CD14基因型和等位基因频率经Hardy-Weinberg遗传平衡定律做吻合度检验。应用卡方检验比较两组CD14基因型和等位基因频率分布，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡定律吻合度检验病例组与对照组基因型的观察值和期望值均符合Hardy-Weinberg的平衡法则，吻合度检验良好(P＞0.05)。

2.2 病例组与对照组CD14基因型和等位基因频率分布的比较变应性鼻炎组与对照组-159位点基因型分布均以CT型最常见，其次是TT基因型，T等位基因分布频率最高，病例组CC、CT、TT 3种基因型频率分别为16.7%、46.7%、36.7%，对照组CC、CT、TT 3种基因型频率分别为21.7%、42.7%、36.6%。C、T等位基因分布频率分别为40%、60%和43%、57%。病例组与对照组之间CD14基因型和等位基因频率的分布差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

2.3 新疆维吾尔、汉族CD14基因型和等位基因频率分布的比较维吾尔族、汉族CD14基因启动子-159位点基因型分布均以CT型最常见，其次是TT基因型，T等位基因分布频率最高。在同一民族中，维吾尔族病例组与对照组间CD14各基因型和等位基因频率的分布差异无统计学意义(P＞0.05)，汉族病例组与对照组间基因型和等位基因频率分布差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

2.4 不同种群地区与新疆地区维吾尔、汉CD14/ -159基因型频率和等位基因频率的比较新疆地区人群CD14/-159位点多态性与广东、德国、美国、澳大利亚人群相比有统计学意义，而与其他种群相接近，见表3。

表1 新疆地区变应性鼻炎和对照组CD14/-159基因型和等位基因频率分布的比较/例(%)

表2 新疆地区维吾尔、汉族CD 14/-159基因型和等位基因频率分布的比较/例(%)

3 讨论

CD14是人体组织和细菌分泌的类毒素(即脂多糖，lipopolysaccharide，LPS)首先发生反应的受体，在单核巨噬细胞和嗜中性粒细胞表面表达［12］。从免疫学角度看，CD14和LPS之间的相互反应将激活细胞因子IL-12的活性，由此引发以Thl细胞为主体的免疫应答反应，其结果可抑制IgE的产生从而影响变应性疾病的发生［13］。1999年，美国一组研究人员Baldini等［14］发现位于CD14基因启动子(promoter)-159位点上的多态性(由碱基C变成T)可以增强CD14的活性，并通过激活IL-12的活性而增强Thl细胞功能和降低IgE的产生，高加索白人变应性疾病儿童CD14基因的CC和CT基因型血清总IgE水平较TT型高，而可溶性CD14较TT低，显示C等位基因与变应性疾病有关。关于AR与CD14基因研究较多，但结果各异。Han等［15］调查中国北京成年人变应性鼻炎患者TT纯和子较CC和CT基因型常见，CD14 C-159 T多态性与血浆IgE水平无关。Kang等［16］发现CD14基因-159位点多态性在韩国儿童常年变应性鼻炎的发展过程中具有重要作用，CC基因型与CT和TT基因型比较有高的皮肤点刺阳性率和高的血浆IgE水平。Kowal等［17］研究CD14多态性与气道反应性不同有关，与IgE反应有关。PAl-1和CD14相互作用影响变应性哮喘的易感性。随着世界各国研究人员加入这一研究行列，也有相当一部分研究结果发现这些CD14基因多态性与CD14的活性及变应患者(鼻炎和哮喘)血清总IgE浓度和症状无关。而且，多态性的发生率在不同种族人群中有差异［18-19］。将新疆地区维吾尔族、汉族该位点多态性与北京、重庆、广东、湖北、台湾、日本、德国、美国、澳大利亚等不同种群进行比较，结果显示，新疆地区人群CD14/-159位点多态性与广东、德国、美国、澳大利亚人群相比差异有统计学意义，而与其他种群相接近。有几个原因解释这些矛盾:能力的缺乏;连锁不平衡;基因和基因的相互作用;人群混居、基因与环境的相互作用。如果这个SNP与编码蛋白的功能改变有关，就能调节变应性疾病的易感性。这种影响可能是适度的依赖于其他共同存在的特定种群、遗传和环境危险因素［20］。

表3 不同种族人群CD14基因-159基因型和等位基因分布频率的比较/例(%)

本研究采用病例-对照研究方法，在新疆维吾尔族和汉族人群中，对CD14基因-159C/T位点多态性与变应性鼻炎的关系进行了研究，未证实基因多态性与维吾尔族、汉族变应性鼻炎的发病有关联。研究结果与国内外的报道有相同之处，也有不同之处。其原因:(1)变应性鼻炎是一种具有遗传倾向的多基因疾病，有多个候选基因，每个基因又是微效基因，不能明确是由某个基因主导。(2)环境因素与遗传因素相互作用，两者的多样性表现出AR不同的表现型和异质性。特别是近3年基因与环境的相互作用已经成为哮喘和变态反应性疾病遗传学的主旨［21］。(3)种族差异、地域差异以及研究多态性方法的不同也是研究结果不一致的原因之一。(4)样本量的大小、性别匹配以及抽样误差亦是造成研究结果不一致的原因。综上所述，新疆地区维吾尔族和汉族在AR的发病上可能存在有其他未知的遗传或环境因素对AR的发病起着作用。但对CD14基因与AR的确切关系以及它是如何与其它致病基因相互作用引发AR的，仍有待进一步研究。

致谢:感谢上海天昊遗传分析中心的工作人员对本研究给予的帮助和支持!

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Association of CD14 gene-159C/T polymorphism with allergic rhinitis in Xinjiang Uyghur and Hans

HU Haifang1，FAN Yuqin2，W ANG Yan2，YANG Yuping2，ZHANG Hua2
(1Department of Otorhinolaryngology，Toutunhe Center Hospital，Urumqi 830000，China;2Department of Otorhinolaryngology，The First Affliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi830054，China)

Objective To investigate the relationship between the CD14 gene-159C/T polymorphisms and allergic rhinitis(AR)in Xinjiang Uyghur and Hans populations.Methods Three hundred individuals had AR and 300 were healthy controls.We identified the CD14/-159 SNP used SNaPshot technical.The case-control analysis was adopted the frequencies of genotypes and alleles.The distribution of genotype frequencies and allele in the Chinese Xinjiang Uyghur and Han population were compared with other different populations from Beijing，Chongqing，Hubei，Guangdong，Taiwan，Germany，Japan，the United States，and Australia.Resu lts The distribution of genotypes or alleles of CD14gene-159C/T had no differences between the AR group and the control group in both the Xinjiang Uyghur and Hans populations(P＞0.05).The frequencies of genotypes and alleleswere not different between the Han AR and Han control group(P＞0.05).The frequencies of genotypes and alleleswere not differentbe-tween the Uyghur AR and Uyghur control group(P＞0.05).The distribution of genotype frequencies and allele of CD14-159C/T in the Chinese Xinjiang Uyghur and Han population are quite different from Chinese Guangdong Han populations，American，German and Australian(P＜0.05).Conclusion The CD14/-159C/T polymorphismswere not different between the Chinese Xinjiang Uyghur and Han population.Themajor genotype frequencies and allele were both CT and T.No relationship between CD14/-159 SNP and AR was found.

Uyghur ethnic;Han ethnic;Allergic Rhinitis;CD14 gene;polymorphism

R765.21

A

1009-5551(2015)06-0664-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.06.002

2014-12-10］

(本文编辑杨晨晨)

国家自然科学基金(30860310)

胡海芳(1975-)，女，硕士，副主任医师，研究方向:耳鼻咽喉疾病诊治。

张华，女(维吾尔族)，博士，主任医师，教授，博士生导师，研究方向:耳鼻咽喉疾病基础与临床防治研究，E-mail:hzhang1106@163.com。