王广操，崔鹏超，何 玉，张梦岩，苑文涛，王先炜

(南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，江苏 南京 210095)

猪细小病毒 3型(Porcine parvovirus 3，PPV3)已相继于香港[1]， 德国[2]、 罗马尼亚[3]和匈牙利[4]等地区和国家报道。PPV3属于Hokovirus属，基因进化树显示PPV3与人细小病毒4型、5型(PARV4/5)和牛细小病毒4型(Bovine parvovirus，BPV4)的同源性很高，3者处于同一进化分支[5-6]。近年来研究发现该病的感染率越来越高，并且存在突破种属屏障的可能。Cadar报道称，2006年～2007年 PPV3在罗马尼亚的检出率为22.8%，2010年～2011年检出率为50.5%[7]；Csa'gola等认为PPV3正处在突破种属屏障、逐渐适应新宿主的过程[8]。感染范围广、适应能力强是PPV3的主要特征。

目前PPV3的检测方法研究局限于PCR检测和基因测序。研究表明，PPV3的结构蛋白能够识别不同宿主细胞的特异性受体，这对其侵入机体起着至关重要的作用[9]。因此，本研究通过原核表达PPV3 VP2蛋白的主要抗原表位区蛋白，初步建立了检测PPV3的间接ELISA方法，为PPV3早期感染的提供了有效的检测方法。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 pET-28a载体、E.coliDH5α、E.coliBL21均由本实验室保存；PPV3阴、阳性血清和376份血清均筛选自临床送检样品；猪瘟病毒(CSFV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪圆环病毒 2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒 1型(PPV1)和PPV2等阳性血清均由本实验制备保存。辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白(HRP-SPA)购自武汉博士德生物工程有限公司；四甲基联苯胺(TMB)购自碧云天生物技术研究所；限制性内切酶、2×Taq Master Mix、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker均购自TaKaRa公司；DNA回收试剂盒购自上海鼎国生物技术有限公司；质粒提取试剂盒购自Biomiga公司。

1.2 引物设计及合成 参照GenBank中登录的PPV3 VP2基因序列(KC701330.1)，采用DNAStar软件对VP2结构蛋白的亲水性、可及性及抗原性指数进行分析，应用Primer Premier 5.0软件设计1对特异性引物扩增VP2蛋白的主要抗原表位编码区，预期扩增片段为540 bp。引物由上海英俊生物技术有限公司合成，引物序列为：5'-CCCGGATCCATGGGAC GAGAGTTT-3'(BamHⅠ)/5'-TTCGTCGACTTAGCCG GTATAACTT-3'(SalⅠ)。

1.3 目的片段的扩增及克隆 采用酚氯仿法提取病毒基因组为模板，PCR反应条件为：95℃5 min；94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 40 s； 72℃ 10 min。PCR产物经BamHⅠ/SalⅠ酶切后克隆至pET-28a载体，构建重组质粒pET-540。

1.4 重组蛋白的表达、纯化及鉴定 将重组质粒pET-540转化至受体菌BL21，37℃震荡培养至OD600nm为0.6～0.8，经终浓度为0.8 mM 的IPTG诱导表达4 h。于4℃离心收集菌体，超声波裂解后分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳检测分析其表达形式。重组蛋白(rVP2)经纯化后进行SDS-PAGE，并转印至NC膜，以PPV3阳性血清(1∶100)为一抗， HRP-SPA(1∶10000)为二抗， 进行western blot鉴定。

1.5 间接ELISA方法的建立及反应条件的优化采用方阵滴定法，将抗原和血清按不同浓度进行倍比稀释，确定最佳包被浓度和最佳血清稀释度。抗原蛋白稀释终浓度分别为 0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL 和 8.0 μg/mL，血清稀释度依次为 1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400和 0(空白对照)。以阳性血清 OD450nm值介于1.0～1.2和阴性血清 OD450nm值低于 0.1，并且 P/N值最大的孔所对应的抗原包被浓度和血清稀释度为最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度。

同时对抗原包被时间、封闭液的选择及作用时间、最佳一抗作用时间、酶标二抗稀释倍数和作用时间、显色液和显色时间等进行优化。

1.6 临界值的确定 采用已建立的ELISA方法筛选出40份PPV3阴性血清(OD450nm<0.25)。根据生物统计学原理计算OD450nm的平均值()和标准差(SD)，并以此确定血清样品为阳性或阴性的临界值：若检测样品的OD450nm≥±3SD则为阳性，OD450nm<±2SD则为阴性，介于两者之间为可疑。

1.7 特异性试验 采用建立的ELISA方法，分别检测 CSFV、FMDV、PCV2、PRV、PRRSV、PPV1和PPV2的阳性血清，同时设立PPV3阳性、阴性对照，检测该方法特异性。

1.8 重复性试验 采用同一批次表达纯化的rVP2包被酶标板，按照已建立的ELISA方法对3份阳性血清(强阳、中阳和弱阳)和2份阴性血清进行检测，每份样品设置3个重复孔进行批内重复性试验。同时使用3个不同批次表达纯化的rVP2同时包被酶标板，进行批间重复性试验。

1.9 临床血清样品的检测 利用建立的间接ELISA方法对来自江苏、山东、浙江、安徽、四川和广东等地的376份血清样品进行检测，收集数据进行统计分析。

2 结果

2.1 重组质粒的构建及鉴定 以提取的PPV3 DNA为模板，经过PCR扩增获得约为540 bp的目的片段，与预期相符(图略)。将其克隆至原核表达载体pET-28a中，重组质粒经BamHⅠ/SalⅠ酶切鉴定，结果表明重组质粒pET-540构建正确。

2.2 重组蛋白的表达、纯化及鉴定 将重组质粒pET-540经诱导表达后，进行SDS-PAGE电泳检测，结果显示有40 ku的蛋白条带，与预期结果相符，表明rVP2得到了表达，并且以包涵体的形式存在(图1A)。采用常规包涵体纯化方法制备纯化的重组蛋白。Western blot结果显示该重组蛋白可以与PPV3阳性血清发生特异性反应，具有良好的反应原性(图 1B)。

图1 重组蛋白表达的SDS-PAGE(A)检测和western blot(B)鉴定Fig.1 Detection and identification of the recombinant VP2 expression by SDS-PAGE(A)and western blot(B)

2.3 间接ELISA方法的建立

2.3.1 最佳反应条件的确定 经方阵滴定试验，最终确定该间接ELISA的最优反应条件见表1。37℃显色6 min。

表1 间接ELISA检测方法的反应条件优化结果Table 1 The optimized conditions of the indirect ELISA

2.3.2 临界值的确定 采用建立的间接ELISA方法检测40份阴性血清，结果显示：血清的为0.194，SD为0.041，因此+3SD和+2SD分别为0.317和0.276，即当血清OD450nm值大于0.317时判定为阳性，小于0.276时判定为阴性，介于两者之间时为可疑(图 2)。

图2 阴性血清OD450nm值分布图Fig.2 OD450nmvalue of negative sera distribution

2.4 特异性试验 使用建立的ELISA方法同时检测 CSFV、FMDV、PCV2、PRV、PPV1、PPV2和PRRSV标准阳性血清，结果显示除PPV3阳性血清为阳性外，其余病原血清的OD450nm值均为阴性(表2)，表明该方法具有良好的特异性。

表2 间接ELISA的特异性试验结果Table 2 The result of specificity test of indirect ELISA

2.5 重复性试验 使用同一批次和3个不同批次表达纯化的rVP2包被酶标板，以建立的ELISA方法检测。结果显示，批内和批间重复试验的变异系数均小于10%，表明该方法具有良好的重复性(表3)。

表3 间接ELISA重复性试验(n=6)Table 3 Repeatability assay for indirect ELISA(n=6)

2.6 临床血清样品的检测 利用建立的间接ELISA方法对376份临床血清样品进行检测，结果显示其中PPV3阳性血清105份(强阳性63份，弱阳性42份)，疑似阳性血清18份，阴性血清253份。PPV3抗体阳性检出率为27.9%，表明我国PPV3的感染较为严重，本实验建立的ELISA方法可用于PPV3的临床检测。

3 讨论

目前，国内关于PPV3的检测主要以PCR检测和血清学试验为主，但步骤繁琐，对设备要求较高，不适合批量检测，而间接ELISA方法不仅敏感度高、特异性强、重复性好，而且具有低成本和易操作等优点，已在临床检测中广泛应用[10]。目前，国内尚未见关于PPV3 ELISA检测方法的报道，因此本实验建立了PPV3的ELISA方法，以期为该病的防制与检测提供新的技术手段。

PPV3 VP2是该病毒最为重要的核衣壳结构蛋白，本实验室前期表达了VP2全蛋白和一段截短蛋白，但VP2全蛋白表达量低并且纯化效果不好，不适合大量表达和建立ELISA方法，而选用的截短序列为VP2中高度保守的一段，并且具有良好的亲水性和免疫原性，因此选用rVP2作为检测PPV3相关抗体的抗原。

本研究采用原核表达载体pET-28a表达重组蛋白并对其纯化，有效去除了菌体蛋白，获得纯度较高的目的蛋白，提高了该方法的准确性。通常抗原的包被浓度过高会造成抗原分子的多层化，进而导致抗原-抗体复合物容易被洗掉，若抗原包被浓度过低，酶标板表面会出现未被抗原吸附的空位，易出现假阴性[9,11]。本研究通过原核表达PPV3截短蛋白作为ELISA诊断抗原，通过对不同反应条件的反复摸索，确立了间接ELISA方法的最佳反应条件，并具有高度的特异性和良好的重复性。将该方法应用于猪临床血清的检测，结果表明目前我国普遍存在PPV3的感染。

本研究通过原核表达PPV3 VP2截短蛋白作为包被抗原，初步建立了临床检测PPV3的间接ELISA方法，为临床检测血清和进行流行病学调查奠定了基础。

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