叶崇军李 冰孟 艳魏兆军陈复生

（1安徽省农业科学院蚕桑研究所，安徽合肥 230061；2安徽农业大学生命科学学院，安徽合肥 230036；3合肥工业大学生物与食品学院，安徽合肥 230009）

全天然丝胶蛋白的提取及酶解条件的筛选

叶崇军1，2李 冰1孟 艳2魏兆军3陈复生1

（1安徽省农业科学院蚕桑研究所，安徽合肥 230061；2安徽农业大学生命科学学院，安徽合肥 230036；3合肥工业大学生物与食品学院，安徽合肥 230009）

以天然丝胶蚕茧为材料，采用冷冻干燥法和喷雾干燥法提取丝胶蛋白，选择蛋白水解酶对丝胶蛋白进行酶解反应，研究酶解规律，并根据SDS－PAGE的方法测定丝胶蛋白及其酶解产物的分子量。结果显示：真空冷冻干燥法提取的丝胶蛋白得率较高，而喷雾干燥则更适于工业化生产；木瓜蛋白酶对丝胶蛋白的降解效果优于中性蛋白酶；在pH值8.0、木瓜蛋白酶浓度4.0%（w／v）、丝胶蛋白浓度10.0%（w／v）、反应温度50℃、反应时间120 min的条件下，可以得到小分子量的丝胶多肽（5～12 kD）。

丝胶蛋白；提取方法；蛋白水解酶；小分子量；丝胶多肽

蚕丝是人类最早利用的天然蛋白之一，长期以来，它一直主要应用在纺织、服装领域，而对其在其它领域的开发利用则相对较少。近年来，随着生物医药技术的迅速发展，国内外对蚕丝，特别是丝胶蛋白的新功能材料开发和综合利用已日趋广泛。现有研究表明丝胶蛋白具有抗菌［1］、防紫外［2］、保湿［3］、抗氧化［4］等功能特性，在化妆品、食品、生物医学以及生物技术等领域具有良好的应用前景［5－6］。

丝胶蛋白质的相对分子质量为14～314 kD［7］，须经过水解，才能最大限度地发挥其功效。在涉及丝胶蛋白的多功能应用开发中，需要将大分子丝胶蛋白水解至小分子多肽，甚至游离氨基酸。因此，将丝胶蛋白进行水解，制取一定分子量的多肽形式，成为亟待解决的问题。通常，对丝胶的水解常用酸、碱等化学法，但这些方法都存在诸多缺点。酶解法研究丝胶蛋白的降解作用，具有独特的优点［8］。这不仅是因为酶水解作用条件温和，效率高，不破坏原有蛋白质的氨基酸组成，而且由于它的高度专一性，可根据不同的应用需要，来制备不同的多肽产品；同时，由于人体体液中也含有微量的多种蛋白分解酶［9］，为丝胶医用材料在人体环境下的应用提供了先天的降解条件。因而，利用生物酶来水解天然丝胶蛋白，可行性较高。

为有效发挥丝胶蛋白的功能特性，满足化妆品、食品、医药等领域创新产品的研制和生产对蛋白质不同分子量大小的严格要求，本研究以天然丝胶蚕茧为素材，采用冷冻干燥法和喷雾干燥法提取丝胶蛋白，选择不同的蛋白水解酶，将大分子的丝胶蛋白降解至小分子多肽，并对酶解条件进行优化，为高效、合理开发利用丝胶资源提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

全天然黄绿色丝胶蚕品种：绿S，由安徽省农业科学院蚕桑研究所保存，按照正常条件饲养，化蛹后取蚕茧的茧壳备用。

试剂与仪器设备：中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，南宁庞博生物工程有限公司产品；十二烷基硫酸钠（SDS）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、蛋白质分子量标准（宽），Sigma公司产品；其他试剂均为分析纯。HH－2恒温水浴锅，国华电器有限公司产品；RE－52型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品；FE20 pH计，梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司产品；LGJ－12型冷冻真空干燥仪，北京松源华兴科技发展有限公司产品；台式高效冷冻离心机，Thermo公司产品；Tanon－1600凝胶成像仪，上海天能公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 全丝胶蛋白的提取与干燥方法比较 用温水洗涤茧壳，去掉赃物，烘干（60℃）后剪成约1 cm2的碎片；称取15 g碎茧壳，加入蒸馏水750 mL，放入灭菌锅，在125℃煮2.5 h，用纱布过滤后，生丝用温水洗涤3遍，合并蚕丝脱胶液和洗涤液，然后用滤纸抽滤，丝胶溶液在80℃旋转蒸发，即得丝胶蛋白浓缩液，－4℃冷藏备用。

将300 mL丝胶蛋白浓缩液放在温度50～60℃，压强0.1 MPa条件下，真空浓缩至约100 mL，然后进行预冻（丝胶蛋白浓缩液的预冷温度是－40℃，2 h完全冻结），在样品温度－33℃，压强1 Pa条件下进行冷冻干燥。将300 mL丝胶蛋白浓缩液在进口热风温度195℃、排风温度95℃、风机转速50 Hz条件下，进行喷雾干燥，比较2种干燥方法丝胶蛋白的提取率。

1.2.2 丝胶蛋白酶的筛选 分别选取中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，在酶浓度1%、pH值7.0、反应温度60℃、底物浓度10%、反应时间120 min的条件下，对提取的丝胶蛋白进行酶解，并采用SDS－聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS－PAGE）的方法测定酶解产物的分子量（12%分离胶，5%浓缩胶）［11］。根据标准分子质量蛋白质的分布状态，得到丝胶蛋白样品和丝胶蛋白酶解产物的分子质量的分布情况，然后选择能将丝胶蛋白降解为小分子量的蛋白酶，进行酶解条件的研究。

1.2.3 不同pH值对丝胶蛋白降解的影响 设pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，称取丝胶蛋白粉1 g，在酶浓度1%、底物浓度10%、反应时间120 min、反应温度60℃的条件下，对丝胶蛋白进行酶解；酶解液经5 000 r／min离心10 min后，测定丝胶多肽的分子量分布，选择最适pH值。

1.2.4 不同酶浓度对丝胶蛋白降解的影响 设酶浓度分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和4.0%（w／v），称取丝胶蛋白粉1 g，选择最适pH值，在底物浓度10%、反应时间120 min、反应温度60℃的条件下，对丝胶蛋白进行酶解，测定酶解液中丝胶多肽的分子量分布，选择最佳酶浓度。

1.2.5 不同底物浓度对丝胶蛋白降解的影响 设底物浓度分别为1.0%、5.0%、10.0%、15.0%和20.0%（w／v），称取丝胶蛋白粉1 g，选择最适pH值和酶浓度，在反应时间120 min、反应温度60℃的条件下，对丝胶蛋白进行酶解，测定酶解液中丝胶多肽的分子量分布，选择最佳底物浓度。

1.2.6 不同反应时间对丝胶蛋白降解的影响 设反应时间分别为0、30、60、120、180 min，称取丝胶蛋白粉1 g，选择最适pH值、酶浓度和底物浓度，在反应温度60℃的条件下，对丝胶蛋白进行酶解，测定酶解液中丝胶多肽的分子量分布，选择最佳反应时间。

1.2.7 不同反应温度对丝胶蛋白降解的影响 设反应温度分别为20、30、40、50、60℃，称取丝胶蛋白粉1 g，选择最适pH值、酶浓度、底物浓度和反应时间，对丝胶蛋白进行酶解，测定酶解液中丝胶多肽的分子量分布，选择最适反应温度。

2 结果与分析

2.1 不同干燥方法对丝胶蛋白提取率的影响

不同干燥方法提取丝胶蛋白的得率存在较大的差异，冷冻干燥法得到的绿S丝胶蛋白得率较高，可以达到77.68%，而喷雾干燥法的丝胶蛋白得率只有30.80%，远远低于冷冻干燥法的得率。造成这种现象的主要原因，可能是因为喷雾干燥法粘壁现象较为严重，雾化效果有待改善。经干燥处理能提取这么多的丝胶蛋白，与蚕品种的特性有关，绿S是安徽省农业科学院蚕桑研究所保存的全天然丝胶品种，其含有的丝胶蛋白比普通蚕品种要高得多［12］。

2.2 不同丝胶蛋白酶的酶解效果

在酶浓度1%、pH值7.0、反应温度60℃、底物浓度10%、反应时间120 min的条件下，用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶对丝胶蛋白的酶解效果进行比较，从不同蛋白酶对丝胶蛋白的酶解效果（图1）可以看出，木瓜蛋白酶的酶解效果优于中性蛋白酶，丝胶蛋白经蛋白酶酶解后，其丝胶多肽的分子量分布范围较广，从14 kD到200 kD都有分布；木瓜蛋白酶降解后的丝胶多肽分子量分布则明显变窄，而中性蛋白酶对丝胶蛋白的酶解作用则不明显。因此，选取木瓜蛋白酶进行酶解条件的研究。

2.3 不同pH值对丝胶蛋白降解的影响

为了检验pH值对木瓜蛋白酶水解丝胶蛋白的影响，在酶浓度1%、底物浓度10%、反应温度60℃、反应时间120 min的条件下，分别用pH值5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，采用SDS－PAGE分析法对丝胶蛋白进行酶解，从不同pH值对丝胶蛋白降解的影响（表1）可以看出，木瓜蛋白酶对丝胶蛋白的酶解作用随着pH值的增加，其酶解后的丝胶多肽分子量分布范围发生显著变化；当pH值为5.0时，丝胶多肽分子量分布在5～200 kD；而当pH值为8.0时，丝胶多肽分子量则分布在5～25 kD；因此，木瓜蛋白酶水解丝胶蛋白的适宜pH值为8.0。

表1 不同pH值对丝胶蛋白降解的影响

2.4 不同酶浓度对丝胶蛋白降解的影响

从不同酶浓度对丝胶蛋白降解的影响（表2）可以看出，木瓜蛋白酶对丝胶的水解作用随着酶浓度的改变而发生显著变化，在pH值为8.0、反应温度60℃、底物浓度10%、反应时间120 min的条件下进行酶解，随着酶浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和4.0%）的提高，丝胶多肽的分子量的分布范围变小；当酶浓度在0.5%时，丝胶多肽的分子量的分布范围是5～110 kD；当酶浓度在4.0%时，丝胶多肽的分子量的分布范围是5～18 kD；因此，木瓜蛋白酶水解的最佳酶浓度为4.0%。

表2 不同酶浓度对丝胶蛋白降解的影响

2.5 不同底物浓度对丝胶蛋白降解的影响

在pH值8.0、酶浓度4.0%、反应温度60℃、反应时间120 min的条件下进行酶解，随着底物浓度（1.0%、5.0%、10.0%、15.0%和20.0%）的增加，木瓜蛋白酶水解丝胶的最佳酶浓度在逐渐下降；当底物浓度为1.0%时，木瓜蛋白酶水解丝胶的效果最佳，其水解产物丝胶多肽的分子量分布在5～10 kD；当底物浓度为10.0%时，其水解产物丝胶多肽的分子量分布在5～14 kD；而当底物浓度增加到20.0%时，木瓜蛋白酶对丝胶的水解效果欠佳，丝胶多肽的分子量分布在5～200 kD（表3）。考虑到酶解效率，选择10.0%的底物浓度为最适底物浓度。

表3 不同底物浓度对丝胶蛋白降解的影响

2.6 不同反应时间对丝胶蛋白降解的影响

在酶浓度4.0%、pH值8.0、底物浓度10.0%、反应温度60℃的条件下进行酶解，木瓜蛋白酶对丝胶蛋白的水解程度随着反应时间（0、30、60、120、180 min）的增加而增加；当反应时间为120 min时，水解产物的分子量分布在5～50 kD；当反应时间增加到180 min时，木瓜蛋白酶降解丝胶蛋白的水解产物的分子量的总体分布未发生显著改变（表4）；因此，最佳反应时间为120 min。

表4 不同反应时间对丝胶蛋白降解的影响

2.7 不同反应温度对丝胶蛋白降解的影响

在最佳酶浓度4.0%、pH值8.0、底物浓度10.0%、反应时间120 min的条件下，对丝胶蛋白进行酶解时，木瓜蛋白酶对丝胶的水解产物分子量分布，随着反应温度（20、30、40、50、60℃）的变化发生明显改变；当反应温度从20℃增加到30℃时，木瓜蛋白酶水解产物的分子量分布从5～200 kD，降低到5～90 kD；而当反应温度从40℃增加到60℃时，木瓜蛋白酶仍保持较强的水解活性（表5）。考虑到过高的温度容易使蛋白变性，所以，选择的最佳反应温度为50℃。

表5 不同反应温度对丝胶蛋白降解的影响

3 讨论

冷冻干燥法获取丝胶蛋白的效果优于喷雾干燥法，采用冷冻干燥法可获得77.68%的丝胶蛋白，而喷雾干燥法为30.80%，少了46.88个百分点。在冷冻干燥法和喷雾干燥法干燥工艺的对比中发现，冷冻干燥始终是在低温和真空状态下进行，有利于保持产品的功能特性和理化特性；但冷冻干燥的耗时较长（至少48 h），并且在此过程中要抽真空、制冷和加热，所以能耗也相对较高，一次处理物料的量也相对较少，每次只能干燥数百毫升的浓缩液，虽然得率较高，但如果应用于工业生产，将大大增加成本，效率也非常低，只适合实验室研究，不适合大规模地商品化生产丝胶蛋白产品。而喷雾干燥的过程是在瞬间完成的，也可以连续进料，不仅大大提高了效率，也节约了时间，所需设备简单、成本较低、产量高，适合大规模的连续化生产。可以认为喷雾干燥法是冷冻干燥法在丝胶蛋白商品化生产中的替代。

近年来，丝胶蛋白的多领域研究和开发成为热点，但回收的丝胶蛋白不仅纯度低、容易变性，污染严重，而且工程繁杂，效率低，成本高，与广泛的多领域应用也有较远的距离。丝胶蛋白的大量生产，选育全天然纯丝胶蚕新品种是最有效的捷径，可以省略回收程序、节约成本、回避污染、保证绿色环保，直接投入多领域的利用，发挥其巨大的社会、经济和生态效益。本研究的结果显示，从全天然丝胶蚕茧中提取了较高含量的丝胶蛋白（77.68%），这主要归因于品种特性。利用日本引进的丝胶品种资源和自主创新品种资源，采用远缘杂交、基因导入、定向选育等方法［12］，育成的特殊丝胶蚕品种的丝胶蛋白含量较高，利用此特殊丝胶蚕品种可以大量生产优质的全天然、纯丝胶蛋白。

丝胶及其水解产物可应用于很多领域，但是其应用须依赖于分子量。丝胶多肽的分子量在20～200 kD之间变化。丝胶及其衍生物不能充分溶于水，需要被降解至小分子多肽，才能应用于其他领域。有报道称丝胶多肽覆盖着的纤维能预防磨损皮肤的受伤及皮疹的进一步发展［11］。亲水的纤维可通过依附0.1%～5.0%丝胶多肽，成为人造丝或棉的表面材料［3］。此外，这些改良的纤维是能吸收的，而不会引起皮疹。在哺乳类动物或昆虫细胞的培养基中使用的胎牛血清或牛血清白蛋白可以替换成平均分子量为30 kD的丝胶多肽［13］。当丝胶多肽（4～60 kD）与头发护理产品中水溶性的壳聚糖衍生物和三甲胺衍生物发生相互作用，其优良性能得到进一步显现［14］。低分子量的丝胶多肽（≤20 kD）可用作化妆品，包括皮肤护理产品和头发护理产品、保健品和药物。

本试验结果表明，采用木瓜蛋白酶水解效果较好，经试验研究在酶解条件为pH值8.0、木瓜蛋白酶浓度4.0%、丝胶蛋白浓度10.0%、反应温度50℃、反应时间120 min的条件下，对丝胶蛋白进行水解，可以得到小分子量的丝胶多肽（5～12 kD）。但是本研究仅仅考察了pH值、酶浓度、底物浓度等各个单因素对木瓜蛋白酶降解丝胶蛋白的影响，而关于各个因素间的相互影响则有待进一步研究。

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S881.3

A

1007－0982（2015）04－0044－05

2015－02－12；接受日期：2015－06－18

现代农业产业技术体系建设专项（编号CARS－22）；安徽省农业科学院院长青年创新基金项目（编号14B0635）；安徽省农业科学院种子工程项目（编号15B0605）。

叶崇军（1983—），女，安徽六安，硕士，助理研究员。

Tel：0551－62852900，E⁃mail：yechj1983＠163.com

陈复生（1958—），男，博士，研究员。

Tel：0551－62852900，E⁃mail：chenfs58＠hotmail.com